Hoge resolutie vergelijking van bacteriële vervoeging frequenties
Summary
Met een doel te begrijpen van het gedrag van verschillende bacteriële conjugative DNA elementen onder verschillende omstandigheden, beschrijven we een protocol voor de detectie van verschillen in de frequentie van de conjugatie, met een hoge resolutie te schatten hoe efficiënt de donor-bacterie met deze opdracht start Woordherkomst en-opbouw.
Abstract
Bacteriële conjugatie is een belangrijke stap in de horizontale overdracht van antibiotica-resistentiegenen via een conjugative DNA-element. Diepgaande vergelijkingen van geconjugeerde frequentie onder verschillende omstandigheden moeten begrijpen hoe verspreidt het conjugative element in de natuur. Conventionele methodes voor het vergelijken van geconjugeerde frequentie zijn echter niet geschikt voor diepgaande vergelijkingen vanwege de hoge achtergrond veroorzaakt door extra vervoeging gebeurtenissen op de selectieve plaat. We verlaagd met succes de achtergrond door de invoering van een meest waarschijnlijke aantal (MPN) methode en een hogere concentratie van antibiotica ter voorkoming van verdere vervoeging in selectieve vloeistof. Daarnaast ontwikkelden we een protocol voor het inschatten van de kans op hoe vaak donor cellen starten vervoeging gesorteerd enkele donor cellen in ontvangende zwembaden door fluorescentie-activated cell sorting (FACS). Met behulp van twee plasmiden, kon pBP136 en pCAR1, de verschillen in de frequentie van de vervoeging in Pseudomonas putida cellen worden opgespoord in vloeistof tegen verschillende opzwepende tarieven. De frequenties van geconjugeerde Inleiding waren hoger voor pBP136 dan voor pCAR1. Met deze resultaten, kunnen we beter de functies van de vervoeging in deze twee plasmiden begrijpen.
Introduction
Bacteriële vervoeging van mobiele genetische elementen, conjugative plasmiden en integratieve en conjugative elementen (ICEs) is belangrijk voor de horizontale verspreiding van genetische informatie. Het kan bevorderen snelle bacteriële evolutie en aanpassing en overbrengen van multidrug resistentie genen1,2. De vervoeging frequentie kan worden beïnvloed door eiwitten gecodeerd op de conjugative elementen voor mobilisatie van DNA (MOB) en de paring paar vorming (MPF), met inbegrip van geslacht pili, die zijn ingedeeld volgens MOB en MPF type3,,4, 5. Het kan ook worden beïnvloed door de donor en ontvanger paar6 en de voorwaarden van de groei van de cellen7,8,9,10,11,12 ( groeitempo op jaarbasis, celdichtheid, stevige ondergrond of opgietvloeistof, temperatuur, beschikbaarheid van nutriënten en de aanwezigheid van kationen). Om te begrijpen hoe de conjugative elementen verspreid onder bacteriën, is het noodzakelijk om te vergelijken vervoeging frequentie in detail.
De vervoeging frequentie tussen donor en ontvanger paren na de paring worden meestal als volgt geschat door conventionele methoden. (i) ten eerste, het aantal kolonies van donor en ontvanger worden geteld; (ii) dan worden de ontvangende kolonies, waaraan de conjugative elementen (= transconjugants) geteld; (iii) en ten slotte de vervoeging frequentie wordt berekend door de kolonievormende eenheden (kve) van de transconjugants door die van de donor en/of ontvanger13. Wanneer u deze methode gebruikt, is de achtergrond echter hoog als gevolg van extra vervoeging gebeurtenissen die ook op de selectieve platen gebruikt plaatsvinden kunnen voor het verkrijgen van transconjugants wanneer de celdichtheid hoge10is. Het is daarom moeilijk te detecteren van kleine verschillen in frequentie (onder een 10-fold verschil). We introduceerde onlangs een meest waarschijnlijke aantal (MPN) methode met behulp van vloeibaar medium met een hogere concentratie van antibiotica. Hierdoor verminderd de achtergrond door remming van verdere vervoeging in het selectieve medium; Dus, de vervoeging frequentie kan worden geraamd met een hogere resolutie.
Vervoeging kan worden onderverdeeld in drie stappen: (1) bevestiging van de donor-ontvanger paar (2) opening van conjugative overdracht, en (3) dissociatie van het paar14. Tijdens stap (1) en (3) is er fysieke interactie tussen de donor en de ontvanger cellen; Dus, celdichtheid en de milieuomstandigheden kunnen invloed op deze stappen, hoewel de kenmerken van het geslacht pili ook belangrijk zijn. Stap (2) is waarschijnlijk geregeld door de expressie van verschillende genen die betrokken zijn bij de vervoeging in reactie op externe veranderingen, die kunnen worden beïnvloed door verschillende functies van de plasmide, donor en ontvanger. Hoewel de fysieke bijlage of detachement van donor en ontvanger paren kan worden wiskundig gesimuleerd met behulp van een schatting van cellen als deeltjes, worden de frequentie van de stap (2) experimenteel gemeten. Er zijn een paar verslagen over directe waarnemingen van hoe vaak donoren kunnen dit leiden tot vervoeging [stap (2)] met behulp van fluorescentie microscopie15,16; deze methoden zijn echter niet high-throughput omdat een groot aantal cellen moet worden gecontroleerd. Dus, wij een nieuwe methode ontwikkeld om schatting van de waarschijnlijkheid van het optreden van de stap (2) met behulp van fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACS). Onze methode kan worden toegepast op elke plasmide, zonder identificatie van de essentiële genen voor Woordherkomst en-opbouw.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteren we een high-resolution protocol voor de detectie van verschillen in vervoeging frequentie onder verschillende omstandigheden, gebruik een MPN-methode voor de raming van het aantal transconjugants. Een belangrijke stap in het protocol is het verdunnen van het mengsel van donor en ontvanger na de paring tot geen transconjugants groeien. Een andere stap is het toevoegen van hoge concentraties van antibiotica aan de selectieve vloeistof om te voorkomen dat verdere Woordherkomst en-opbouw. Deze procedures kun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. K. Kamachi van het National Institute of Infectious Diseases (Japan) voor het verstrekken van pBP136 en Prof. Dr. H. Nojiri van de Universiteit van Tokio (Japan) voor het verstrekken van pCAR1. Wij zijn ook dankbaar Professor Dr. Molin Sølen van de Technische Universiteit van Denemarken voor het verstrekken van pJBA28. Dit werk werd gesteund door JSPS KAKENHI (Grant nummers 15H 05618 en 15KK0278) aan MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).
Materials
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Sheath solution |
| Fluorospheres (10 μm) | Beckman-Coulter | 6605359 | beads to set up the FACS |
| Incubator | Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | |
| UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96-well plates | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| microplate type Petri dish | AXEL | 1-9668-01 | for validation of sorting |
| membrane filter | ADVANTEC | C045A025A | for filter mating |
| pippettes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 |
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL |
| multi-channel pippetes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP |
0.5-10 μL, 20-200 μL |
| Tryptone | BD Difco | 211705 | |
| Yeast extract | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicin | Wako | 185-01003 | |
| gentamicin | Wako | 077-02974 | |
| kanamycin | Wako | 115-00342 | |
| Petri dish | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubes | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL disposable spinner flask | Corning | CLS3578 |
References
- Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. Towards an integrated model of bacterial conjugation. FEMS Microbiology Reviews. 39 (1), 81-95 (2015).
- Johnson, C. M., Grossman, A. D. Integrative and conjugative elements (ICEs): what they do and how they work. Annual Review of Genetics. 49, 577-601 (2015).
- Garcillán-Barcia, M. P., Alvarado, A., de la Cruz, F. Identification of bacterial plasmids based on mobility and plasmid population biology. FEMS Microbiology Reviews. 35 (5), 936-956 (2011).
- Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).
- Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., de la Cruz, F. The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification. FEMS Microbiology Reviews. 33 (3), 657-687 (2009).
- Shintani, M., et al. Recipient range of IncP-7 conjugative plasmid pCAR2 from Pseudomonas putida HS01 is broader than from other Pseudomonas strains. Biotechnology Letters. 27 (23-24), 1847-1853 (2005).
- Yanagida, K., et al. Comparisons of the transferability of plasmids pCAR1, pB10, R388, and NAH7 among Pseudomonas putida at different cell densities. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 80 (5), 1020-1023 (2016).
- Schuurmans, J. M., et al. Effect of growth rate and selection pressure on rates of transfer of an antibiotic resistance plasmid between E. coli strains. Plasmid. 72, 1-8 (2014).
- Bradley, D. E., Taylor, D. E., Cohen, D. R. Specification of surface mating systems among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K-12. Journal of Bacteriology. 143 (3), 1466-1470 (1980).
- Nakazawa, S., et al. Different transferability of incompatibility (Inc) P-7 plasmid pCAR1 and IncP-1 plasmid pBP136 in stirring liquid conditions. PLoS One. 12 (10), e0186248 (2017).
- Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Effect of ecological factors on conjugal transfer of chromium-resistant plasmid in Escherichia coli isolated from tannery effluent. Biotechnology and Applied Biochemistry. 102 (1-6), 5-20 (2002).
- Sakuda, A., et al. Divalent cations increase the conjugation efficiency of the incompatibility P-7 group plasmid pCAR1 among different Pseudomonas hosts. Microbiology. 164 (1), 20-27 (2018).
- Corliss, T. L., Cohen, P. S., Cabelli, V. J. R-plasmid transfer to and from Escherichia coli strains Isolated from human fecal samples. Applied and Environmental Microbiology. 41 (4), 959-966 (1981).
- Zhong, X., Krol, J. E., Top, E. M., Krone, S. M. Accounting for mating pair formation in plasmid population dynamics. Journal of Theoretical Biology. 262 (4), 711-719 (2010).
- Gilmour, M. W., Lawley, T. D., Taylor, D. E. The cytology of bacterial conjugation. EcoSal Plus. 2004, (2004).
- Minoia, M., et al. Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20792-20797 (2008).
- Kamachi, K., et al. Plasmid pBP136 from Bordetella pertussis represents an ancestral form of IncP-1beta plasmids without accessory mobile elements. Microbiology. 152 (12), 3477-3484 (2006).
- Simon, R., Priefer, U., Pühler, A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Nature Biotechnology. 1 (9), 784-791 (1983).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64 (6), 2240-2246 (1998).
- Shintani, M., et al. Characterization of the replication, maintenance, and transfer features of the IncP-7 plasmid pCAR1, which carries genes involved in carbazole and dioxin degradation. Applied and Environmental Microbiology. 72 (5), 3206-3216 (2006).
- Shintani, M., et al. Single-cell analyses revealed transfer ranges of IncP-1, IncP-7, and IncP-9 plasmids in a soil bacterial community. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 138-145 (2014).
- Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values. Journal of Applied Microbiology. 109 (5), 1660-1667 (2010).
- Haagensen, J. A., Hansen, S. K., Johansen, T., Molin, S. In situ detection of horizontal transfer of mobile genetic elements. FEMS Microbiology Ecology. 42 (2), 261-268 (2002).
- Herrero, M., de Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172 (11), 6557-6567 (1990).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Maeda, K., et al. Complete nucleotide sequence of carbazole/dioxin-degrading plasmid pCAR1 in Pseudomonas resinovorans strain CA10 indicates its mosaicity and the presence of large catabolic transposon Tn4676. Journal of Molecular Biology. 326 (1), 21-33 (2003).
- Takahashi, Y., Shintani, M., Yamane, H., Nojiri, H. The complete nucleotide sequence of pCAR2: pCAR2 and pCAR1 were structurally identical IncP-7 carbazole degradative plasmids. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (3), 744-746 (2009).
