복제 설정된 방법: 양적 측정 꼬마 선 충 수명에 접근 높은 처리량
Summary
여기 우리가 설명 복제 설정 방법, 양적 측정 C. 선 충 수명/생존 하 접근법 및 healthspan 높은 처리량 및 강력한 방법으로 데이터 품질을 희생 하지 않고도 많은 조건의 심사 되므로. 이 프로토콜은 전략 하 고 데이터 복제 집합의 분석을 위한 소프트웨어 도구를 제공 합니다.
Abstract
복제 설정 방법은 양적 측정 수명 또는 꼬마 선 충 선 충의 생존의 동일한 금액에 더 많은 치료 또는 조건 화면을 단일 조사 되므로 높은 처리 방식에 대 한 접근 데이터 품질의 손실 없이 시간. 방법 C. 선 충 작업 대부분 실험실에서 발견 하는 일반적인 장비를 요구 한다 고 따라서 채택 간단 합니다. 접근 각 관측 지점에서 모집단의 독립 샘플 보다 시간이 지남에 단일 샘플 전통적인 경도 방법 시 금에 센터. 점수 다 잘 접시의 우물에 액체를 추가 하는 수반는 자극 하는 선 충 C. 이동 하 고 healthspan에서 측정 변화를 용이 하 게. 복제 설정 방법의 다른 주요 장점으로는 agar 표면 (예: 형 또는 곰 팡이), 공 수 오염 물질의 감소 된 노출 최소한의 동물, 및 견고성 산발적 잘못 채 점 (예: 때 그것은 여전히 죽은 동물을 호출을 처리 살아 있는). 적절 하 게 분석 하 고 복제 세트 스타일 실험에서 데이터 시각화, 사용자 정의 소프트웨어 도구는 또한 개발 되었다. 소프트웨어의 현재 기능 모두 복제 설정 및 전통적인 (카 플 란-마이어) 실험으로 통계 분석 생존 곡선의 복제 세트에 대 한 표시 포함 됩니다. 여기에 제공 된 프로토콜 전통적인 실험적인 접근 복제 설정 방법 뿐만 아니라 해당 데이터 분석에 대 한 개요를 설명 합니다.
Introduction
노화의 유전 기초 이해를 향한 가장 transformative 기술 발전의 한 개 이었다 C. 선 충1; 먹이 기반 RNAi의 개발 RNAi의 실험적인 사용 전에 노화의 많은 고기 유전자 세공 되지 않았습니다. 먹이-기반 RNAi dsRNA 일치 하는 대장균 내에서 생산을 통해 이루어집니다는 생 선 충 C. mRNA: IPTG 중 선 충 C. cDNA의 삽입 또는의 부분에서 양방향 전사를 유도 한 플라스 미드2내의 열려있는 독서 프레임. C. 선 충 에 그대로 피드 박테리아에 의해 생산 하는 대장균, dsRNA 루멘에서 SID-2 막 횡단 단백질3을 통해 장 세포로 수송 이며 다음 SID-14를 통해 동물의 나머지 부분을 통해 배포. 각 셀 내에서 외 인 dsRNA에 의해 처리 됩니다 Dicer 복잡 한 siRNA에 새로운 만들려고 보완 기본 페어링 통해 성숙한 mRNA와 상호 작용 하는 siRNA mRNA 이중. 이 이중 RISC 복합물에 의해 인식 하 고, 그로 인하여 죽 습 생 mRNA5저하. 따라서, 단지 플라스 미드 삽입 변경, 하나 C. 선 충 게놈 내에서 거의 모든 유전자의 기능을 비활성화 수 있습니다. 이 발견의 라이브러리 컬렉션 변형 대장균 주식의 약 86%의 범위를 달성 하기 위해 결합 될 수 있는 몇 가지 큰 먹이 기반 RNAi의 창조에 주도 알려진 C. 선 충 유전자6, 7.
먹이-기반 RNAi의 발전 이후 종합 화면 C. 선 충 에 수명 비활성화 (로 WormBase에 큐레이터 RNAi 형 협회 입증) 때 우리가 참조를 변경 하는 900 개 이상의 유전자의 발견에 지도 gerogenes로. 대부분 장 수 제어에 gerogenes의 역할 몇 정액 보고서에 RNAi 먹이-기반을 통해 발견 되었다 (자세한 내용은 그림 1A 및 추가 파일 1 참조). 경우에 따라 이러한 gerogenes는 RNAi 치료와 수명에 정량 측정을 제공할 수 있는 단일 또는 몇 시간 지점에서 생존 능력 측정에 따라 확인 되었습니다. 다른 경우에,이 유전자가 수명, 추가 나이 관련 된 고기에 있는 변화에 대 한 양적 평가 되었습니다. 예를 들어, 우리는 이전 159 유전자를 정상적이 고 증가 수명 감소 인슐린/IGF-1 신호, 동물의 필요 그리고 healthspan에서 변화를 정량 확인. 이들의 103 유전자 inactivations 귀 착될 progeric 표현 형으로 손실 귀착되 었 다 조기 노화8의 하나 이상의 표시.
일부 gerogenes 100 이상의 연구 (예: daf-16, daf-2, 선생님-2.1)와 연결 된, 400 gerogenes 10 이하의 인용 (그림 1B및 보조 파일 2) 있다. 따라서, 동안 포괄적인 먹이 기반 RNAi 스크린 발견 하 고 엉 특징 상 상속 gerogenes의 수백, 장 수 제어에서 이러한 유전자 기능 및 이러한 유전자 제품 사이 유전 상호 관계 유지 하는 방법을 제대로 공부. 나이 관련 된 고기에 대 한 전체 경도 분석 gerogenes (예: epistatic 상호 작용, asynthetic 상호 작용, 등등) 사이 유전 상호 작용을 식별 하는 데 필수입니다. Gerogenes 사이 유전 상호 관계에 대 한 깊은 통찰력을 얻고 또한 먹이 기반 RNAi의 장점을 활용 하 여 높은 처리량 양적 방법을 필요 합니다.
노화의 가장 일반적인 대리 측정은 수명. C. 선 충 사망률을 측정 하기 위한 전통적인 방법은 작은 인구 샘플 내에서 시간이 지남에 개별 동물의 죽음을 추적 합니다. 동물의 비교적 적은 수 시간이 지남에 따라 하 고 정기적으로 부드럽게 백 금 철사 또는 속눈썹, 생존 (그림 2A)의 지표로 서 운동으로 prodded. 이 방법은 널리 사용 되었습니다, 평균 및 최대 수명, 직접 측정을 제공 합니다. 그러나,이 전통적인 방법은 이다 시간과 상대적으로 낮은 처리량을 동시에 제어 방식으로 측정할 수 있는 조건과 동물의 수를 제한. 시뮬레이션 연구는 최근 많은 C. 선 충 수명 연구 조건9사이의 작은 변화를 안정적으로 감지 수 동물의 충분히 큰 수를 시험 하지 않습니다 발견. 또한,이 전통적인 방법은 차례로 수 소개, 오염 및 손상 하거나 점점, 세 동물을 죽 일 시간 동안 동물의 동일한 코 호트를 반복적으로 처리를 포함 한다.
C. 선 충 수명 측정에 대 한 대체 “복제 세트” 방법론을 개발 했습니다. 이 위해, 나이 동기화, isogenic 동물의 큰 인구 수 작은 인구 (또는 복제)으로 나누어집니다. 충분 한 복제 샘플 계획 된 실험에서 각 시간 포인트를 충당 하기 위해 생성 됩니다. 각 관찰 시간이 시점에서 복제본 중 하나가 죽은 생활의 수를 위해 득점 하 고 검열된 동물, 다음 그 복제 동물 삭제 됩니다. 따라서, 이상의 독립 모집단의 시리즈 전체 인구의 예상된 수명은 주기적으로 샘플링 (그림 2B). 복제 세트를 사용 하 여 잠재적인 환경 오염 없이 반복된 노출의 아무 반복 괴롭히는 있다. 1 회 시점에서 관찰 생존 모든 다른 관측, 처리를 최소화 하 고 적어도 크기 순서에 의해 처리량 증가의 완전히 독립적입니다. 이 RNAi의 수백 클론8,10동시에 대 한 수명에 변화를 quantitate 하을 수 있다.
여기 C. 선 충 수명 복제 세트와 C. 선 충 장 수 득점을 위한 전통적인 방법을 통해 수행을 위한 상세한 프로토콜 선물이. 우리는 방법 사이 비슷한 결과 얻은 것을 보여 줍니다. 우리는 우리가 자유롭게 GPL V3 라이센스 (참조 자료의 테이블)에서 제공 하는 어느 접근 방식을 통해 생성 된 수명 데이터의 그래픽 분석을 지원 하기 위해 개발 된 소프트웨어를 있다. “WormLife” R11, 작성 하 고 Mac OS와 리눅스에서 테스트 되었습니다 데이터를 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)를 포함 한다. 마지막으로, 우리가 비교 하 고 각 방법의 한계를 대조 C. 선 충 수명에 양적 변화를 측정 하는 방법을 선택할 때 다른 고려를 강조.
Protocol
Representative Results
Discussion
두 전통 및 복제 설정된 방법 날짜순 세 동물의 동기화가 필요합니다. 우리는 수정 된 달걀만 벗 성인 치료를 생존 벗 성인, 차 아 염소 산 치료를 사용 하는 동물을 동기화 하는 메서드를 포함 합니다. 이러한 배아 액체에 해치 고 발달 첫번째 애벌레 단계 (L1)에서 체포. L1 동물 식품 (예: 대장균 표현 dsRNA의 유전자)에 시드, 후 동물 개발을 다시 시작 합니다. L1 동물 벗 성인의 차 아 염…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 원고에 설명 된이 작업에 의해 제공 된에 대 한 자금:는 학장 및 대학원 의학 및 건강 과학 센터에 대 한 계산 혁신 (HSCCI);를 통해 치과 학장의 사무실의 로체스터의 대학 사무실 에이징 화목 (AG-NS-0681-10) 엘리슨 의료 재단 새로운 학자 funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.
Materials
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 2mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis | Samuelson Lab | N/A | https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife |
| L4440 Empty Vector Plasmid | Addgene | 1654 | https://www.addgene.org/1654/ |
| Wormbase | http://www.wormbase.org/ | ||
| OASIS | https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ | ||
| Graphpad Prism | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
References
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA [10]. Nature. 395 (6705), 854 (1998).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2000).
- Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H., Hunter, C. P. Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (25), 10565-10570 (2007).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295 (5564), 2456-2459 (2002).
- Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS letters. 579 (26), 5932-5939 (2005).
- Ceron, J., et al. Toward Improving Caenorhabditis elegans Phenome Mapping With an ORFeome-Based RNAi Library. Genome Research. 14 (14), 2162-2168 (2004).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility. Frontiers in Genetics. 8 (June), (2017).
- Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).
- . R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: https://www.r-project.org/ (2018)
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. 발생학. 51 (1), 23-33 (1976).
- Shi, C., Murphy, C. T. Mating Induces Shrinking and Death in Caenorhabditis Mothers. Science. 343 (6170), 536-540 (2014).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 5318910 (282), 457-481 (1958).
- Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
- Rechavi, O., et al. Starvation-induced transgenerational inheritance of small RNAs in C. elegans. Cell. , (2014).
- Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).
- Vanfleteren, J. R., De Vreese, A., Braeckman, B. P. Two-Parameter Logistic and Weibull Equations Provide Better Fits to Survival Data From Isogenic Populations of Caenorhabditis elegans in Axenic Culture Than Does the Gompertz Model. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A (6), B393-B403 (1998).
- Johnson, D. W., Llop, J. R., Farrell, S. F., Yuan, J., Stolzenburg, L. R., Samuelson, A. V. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad Complexes Integrate Diverse Longevity Signals. PLoS Genetics. 10 (4), e1004278 (2014).
- Ogg, S., et al. The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 0119-0128 (2005).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of ageing and development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PloS one. 9 (1), e85964 (2014).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of ageing and development. 131 (5), 364-365 (2010).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
- Larsen, P. L., Albert, P. S., Riddle, D. L. Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans. 유전학. 139 (4), 1567-1583 (1995).
- Shaw, W. M., Luo, S., Landis, J., Ashraf, J., Murphy, C. T. The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling. Current biology. 17 (19), 1635-1645 (2007).
- Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. Worming pathways to and from DAF-16/FOXO. Experimental Gerontology. 41 (10), 928-934 (2006).
- Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of ageing and development. 12 (2), 137-150 (1980).
- Hosono, R. Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine. Experimental gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).
- Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).
- Anderson, E. N., et al. C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mechanisms of ageing and development. , 30-42 (2016).
- Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. 유전학. 161 (3), 1101-1112 (2002).
- Yu, S., Driscoll, M. EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans. Experimental Gerontology. 46 (2-3), 129-134 (2011).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , (2012).
- Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
