प्रतिकृति सेट विधि: मात्रात्मक माप करने के लिए एक उच्च-प्रवाह Approach Caenorhabditis एलिगेंस आयुष्यात
Summary
यहाँ हम प्रतिकृति सेट विधि का वर्णन, मात्रात्मक उपाय करने के लिए एक दृष्टिकोण एक उच्च प्रवाह और मजबूत तरीके से, इस प्रकार डेटा की गुणवत्ता का त्याग के बिना कई शर्तों की स्क्रीनिंग की अनुमति सी. एलिगेंस उंर/ इस प्रोटोकॉल रणनीति विवरण और प्रतिकृति सेट डेटा के विश्लेषण के लिए एक सॉफ्टवेयर उपकरण प्रदान करता है ।
Abstract
प्रतिकृति सेट विधि मात्रात्मक उपाय या Caenorhabditis एलिगेंस सूत्रकृमि के एक उच्च प्रवाह तरीके से अस्तित्व को मापने के लिए एक दृष्टिकोण है, इस प्रकार की अनुमति एक ही अंवेषक के लिए एक ही राशि से अधिक उपचार या शर्तों स्क्रीन डेटा की गुणवत्ता की हानि के बिना समय । विधि आम एलिगेंस के साथ काम कर रहे अधिकांश प्रयोगशालाओं में पाया उपकरण की आवश्यकता है और इस तरह अपनाने के लिए सरल है । प्रत्येक अवलोकन बिंदु पर एक जनसंख्या के स्वतंत्र नमूनों की परख पर दृष्टिकोण केंद्र, बल्कि पारंपरिक अनुदैर्ध्य तरीकों के साथ के रूप में समय के साथ एक एकल नमूना से । स्कोरिंग एक बहु अच्छी तरह से प्लेट, जो सी. एलिगेंस को उत्तेजित करता है और ले जाने के लिए healthspan में परिवर्तन को बढ़ाता है की कुओं को तरल जोड़ने पर जोर देता है । अन्य प्रमुख लाभ प्रतिकृति सेट विधि के कम जोखिम में शामिल हैं आगर हवाई प्रदूषित पदार्थों (जैसे मोल्ड या कवक), पशुओं की न्यूनतम हैंडलिंग, और छिटपुट गलत स्कोरिंग करने के लिए मजबूती (जैसे कि जब यह अभी भी है मृत के रूप में एक जानवर बुला के रूप में जिंदा) । उचित विश्लेषण और एक प्रतिकृति सेट शैली प्रयोग से डेटा visualize करने के लिए, एक कस्टम सॉफ़्टवेयर उपकरण भी विकसित किया गया था । सॉफ्टवेयर की वर्तमान क्षमताओं दोनों प्रतिकृति सेट और पारंपरिक (कापलान-Meier) प्रयोगों, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रतिकृति सेट के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए अस्तित्व curves की साजिश रचने शामिल हैं । यहां दिए गए प्रोटोकॉल पारंपरिक प्रायोगिक दृष्टिकोण और प्रतिकृति सेट विधि का वर्णन करते हैं, साथ ही साथ संगत डेटा विश्लेषण का अवलोकन करते हैं ।
Introduction
उंर बढ़ने के आनुवंशिक आधार को समझने की दिशा में सबसे परिवर्तनकारी तकनीकी प्रगति में से एक- C. एलिगेंस1में खिला आधारित RNAi का विकास किया गया था; RNAi के प्रायोगिक उपयोग से पहले, उंर बढ़ने के कई phenotypes आनुवंशिक रूप से नहीं थे । खिलाने आधारित RNAi ई. कोलाई के भीतर dsRNA के उत्पादन के माध्यम से हासिल की है कि एक अंतर्जात ग. एलिगेंस mRNA मैच: IPTG या तो सी. एलिगेंस सीडीएनए या एक के एक हिस्से की एक डालने भर में द्वि-दिशा प्रतिलेखन लाती है एक प्लाज्मिड2के भीतर ओपन रीडिंग फ्रेम । जब C. एलिगेंस बरकरार ई. कोलाई पर फ़ीड, बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित dsRNA के माध्यम से आंतों की कोशिकाओं में लुमेन से ले जाया जाता है सिड-2 transmembrane प्रोटीन3, और फिर sid के माध्यम से पशु के बाकी के माध्यम से वितरित-14. प्रत्येक कोशिका के भीतर, exogenous dsRNA Dicer परिसर द्वारा सिरना, जो एक नया mRNA-सिरना द्वैध बनाने के लिए पूरक आधार बाँधना के माध्यम से एक परिपक्व mRNA के साथ बातचीत में संसाधित है. इस द्वैध RISC परिसर और सट द्वारा मांयता प्राप्त है, जिससे अंतर्जात mRNA5अपमानजनक । इस प्रकार, केवल प्लाज्मिड डालने बदल कर, एक सी एलिगेंस जीनोम के भीतर लगभग किसी भी जीन के समारोह को निष्क्रिय कर सकते हैं । यह खोज कई बड़े भोजन के निर्माण के लिए नेतृत्व में RNAi पुस्तकालयों आधारित-बदल ई. कोलाई शेयर कि ज्ञात सी एलिगेंस जीन6के लगभग ८६% की कवरेज प्राप्त करने के लिए संयुक्त किया जा सकता है के संग्रह, 7.
खिला-RNAi आधारित, सी एलिगेंस में व्यापक स्क्रीन की उंनति के बाद से अधिक ९०० जीन की खोज करने के लिए नेतृत्व किया है कि जब निष्क्रिय उंर बदल (के रूप में RNAi-phenotype WormBase में उपपादरी संघों द्वारा सबूत), जो हम देखें के रूप में gerogenes । दीर्घायु नियंत्रण में gerogenes के बहुमत के लिए एक भूमिका के माध्यम से की खोज की थी खिला-सिर्फ कुछ लाभदायक रिपोर्टों में RNAi आधारित ( चित्र 1a और पूरक फ़ाइल विवरण के लिए 1 देखें) । कुछ मामलों में, इन gerogenes एक एकल या कुछ समय बिंदुओं पर व्यवहार्यता को मापने के आधार पर पहचान की गई है, जो RNAi उपचार के साथ जीवन में परिवर्तन का एक quantifiable उपाय प्रदान करने में विफल रहता है । अन्य मामलों में, इन जीनों की उम्र में परिवर्तन के लिए मात्रात्मक मूल्यांकन किया गया है, साथ ही अतिरिक्त आयु-संबद्ध phenotypes. उदाहरण के लिए, हम पहले से पहचान की १५९ जीन है कि दोनों सामांय और वृद्धि हुई इंसुलिन के साथ पशुओं की उंर बढ़ी/IGF-1 संकेत, और healthspan में quantified परिवर्तन के लिए आवश्यक थे । इनमें से, १०३ जीन निष्क्रियता एक progeric phenotype में परिणाम, के रूप में नुकसान समय से पहले8उंर बढ़ने के एक या अधिक संकेत में हुई ।
जबकि कुछ gerogenes १०० या अधिक अध्ययन (जैसे डीएएफ-16, डीएएफ-2, सर-२.१) के साथ संबद्ध किया गया है, ४०० gerogenes से अधिक 10 या कम प्रशस्ति पत्र (आंकड़ा 1b, और पूरक फ़ाइल 2) है । इस प्रकार, जबकि व्यापक खिला आधारित RNAi स्क्रीन की खोज की है और cursorily ख्यात gerogenes, कैसे इन जीन दीर्घायु नियंत्रण में समारोह के सैकड़ों विशेषता है, और इन जीन उत्पादों के बीच आनुवंशिक संबंध खराब रहना अध्ययन. उंर के लिए पूर्ण अनुदैर्ध्य विश्लेषण-संबद्ध phenotypes gerogenes (जैसे epistatic बातचीत, asynthetic बातचीत, आदि) के बीच आनुवंशिक बातचीत की पहचान करने के लिए एक शर्त है । gerogenes के बीच आनुवंशिक संबंध में गहरी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के एक उच्च प्रवाह मात्रात्मक विधि है, जो भी खिलाने के लाभों का लाभ उठाने आधारित RNAi की आवश्यकता है ।
उंर बढ़ने का सबसे आम किराए का उपाय है । C. एलिगेंस मृत्यु दर को मापने के लिए पारंपरिक दृष्टिकोण एक छोटी आबादी के नमूने के भीतर समय के साथ व्यक्तिगत जानवरों की मौतों पटरियों । पशुओं की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या समय पर पीछा कर रहे है और आवधिक रूप से या तो एक प्लैटिनम तार या बरौनी के साथ, व्यवहार्यता का एक संकेतक के रूप में आंदोलन के साथ prodded है (चित्रा 2a) । इस विधि व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है, के रूप में यह सरल प्रदान करता है, औसत और अधिकतम उंर के प्रत्यक्ष माप । हालांकि, इस पारंपरिक विधि समय लेने और अपेक्षाकृत कम प्रवाह है, जो जानवरों और शर्तों है कि एक साथ एक नियंत्रित तरीके से मापा जा सकता है की संख्या सीमा है । हाल ही में एक सिमुलेशन अध्ययन में पाया गया कि कई सी. एलिगेंस आयुष्यात अध्ययन नहीं परख पशुओं की एक बड़ी संख्या पर्याप्त करने के लिए मज़बूती से9शर्तों के बीच छोटे परिवर्तन का पता लगाने में सक्षम हो । इसके अलावा, इस पारंपरिक विधि बार बार है, जो बारी में संदूषण परिचय कर सकते हैं, और नुकसान या तेजी से कमजोर, वृद्ध पशुओं को मार सकता है पर पशुओं के समान पलटन हैंडलिंग शामिल है ।
हम एक वैकल्पिक “प्रतिकृति सेट” सी एलिगेंस उंर मापने के लिए पद्धति विकसित की है । यह अंत करने के लिए, उंर की एक बड़ी आबादी-सिंक्रनाइज़, isogenic पशुओं छोटी आबादी (या प्रतिकृतियां) की एक संख्या में विभाजित हैं । पर्याप्त प्रतिकृति नमूने नियोजित प्रयोग में प्रत्येक समय बिंदु को कवर करने के लिए उत्पन्न होते हैं । प्रत्येक अवलोकन समय बिंदु पर, प्रतिकृतियों में से एक रहते हैं, मृत और सेंसर जानवरों की संख्या के लिए बनाए गए है, तो है कि दोहराने के भीतर जानवरों को खारिज कर रहे हैं । इस प्रकार, एक पूरी, स्वतंत्र उपआबादी की एक श्रृंखला के रूप में जनसंख्या की उंमीद की उंर से अधिक समय-अवधि (चित्रा बी) नमूना है । प्रतिकृति का उपयोग कर में सेट वहाँ जानवरों की कोई दोहराया उकसाने है और संभावित पर्यावरणीय संदूषण के लिए कोई दोहराया जोखिम. व्यवहार्यता एक समय बिंदु पर मनाया हर दूसरे प्रेक्षण के पूरी तरह से स्वतंत्र है, जो से निपटने को कम से कम और परिमाण के एक आदेश के द्वारा प्रवाह बढ़ जाती है । यह हमें RNAi क्लोनों के सैकड़ों के लिए एक साथ8,10के लिए उंर में परिवर्तन quantitate करने की अनुमति दी है ।
यहां हम दोनों प्रतिकृति सेट और c. एलिगेंस दीर्घायु स्कोरिंग के लिए पारंपरिक तरीकों के माध्यम से c. एलिगेंस उंर के संचालन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम इस तरह के परिणामों के तरीकों के बीच प्राप्त कर रहे है कि प्रदर्शन । हम जीवन के लिए या तो दृष्टिकोण है, जो हम आज़ादी से एक जीपीएल V3 लाइसेंस के तहत उपलब्ध कराने के माध्यम से उत्पंन डेटा की चित्रमय विश्लेषण में सहायता करने के लिए सॉफ्टवेयर विकसित किया है ( सामग्री की तालिकादेखें) । “WormLife”11आर में लिखा है, और डेटा है, जो मैक ओएस और लिनक्स में परीक्षण किया गया है की साजिश रचने के लिए एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) भी शामिल है । अंत में, हम तुलना करें और प्रत्येक विधि की सीमाओं के विपरीत और अंय बातों पर प्रकाश डाला जब दृष्टिकोण के लिए सी एलिगेंस उंर में मात्रात्मक परिवर्तन उपाय के बीच चुनने ।
Protocol
Representative Results
Discussion
दोनों पारंपरिक और प्रतिकृति सेट विधियों कालानुक्रमिक आयु वर्ग के पशुओं के तुल्यकालन की आवश्यकता है । हम एक विधि है कि सिंक्रनाइज़ gravid वयस्कों, जहां केवल gravid वयस्क के साथ अंडे निषेचित उपचार के हाइपोक्लो?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस पांडुलिपि में वर्णित इस काम के लिए धन द्वारा प्रदान की गई: प्रोवोस्ट के रोचेस्टर कार्यालय के विश्वविद्यालय और चिकित्सा और दंत विज्ञान के डीन कार्यालय के माध्यम से अभिकलनी नवाचार (HSCCI) के लिए हेल्थ साइंसेज केंद्र; एलिसन मेडिकल फाउंडेशन एजिंग फैलोशिप में नए विद्वानों (एजी-एनएस-0681-10) funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी ।
Materials
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 2mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis | Samuelson Lab | N/A | https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife |
| L4440 Empty Vector Plasmid | Addgene | 1654 | https://www.addgene.org/1654/ |
| Wormbase | http://www.wormbase.org/ | ||
| OASIS | https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ | ||
| Graphpad Prism | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
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