시투에 바이오 프로세스에서 단세포 형태학의 실시간 측정을 위한 현미경 검사법

요약

현미경 검사기 에서 광 광학 은 세포 현탁액에서 직접 단일 세포의 크기를 모니터링하기 위해 개발되었다. 실시간 측정은 광 광학 멸균 프로브를 자동화된 이미지 분석에 결합하여 수행됩니다. 형태학적 변화는 성장 상태 및 재배 조건에 의존하여 나타납니다.

초록

미생물 바이오공정에서의 상시 모니터링은 주로 배지의 화학적 및 물리적특성(예를 들어,pH 값 및 용존 산소 농도)으로 제한된다. 그럼에도 불구하고, 세포의 형태는 성장 상태, 제품 축적 및 세포 스트레스에 의존하여 변화하기 때문에 최적의 조건에 적합한 지표가 될 수 있습니다. 더욱이, 단세포 크기 분포는 재배 조건에 대한 정보뿐만 아니라 인구 이질성에 대한 정보도 제공한다. 이러한 정보를 얻기 위해, 광-광학 적 현미경 장치^1은 생물 반응기에서 세포 현탁액에서 직접 단일 세포 크기 분포의 모니터링을 가능하게하기 위해 개발되었다. 자동화된 이미지 분석은 사용자가 추가한 이미지로 학습되는 신경망 모델을 기반으로 현미경 검사법에 결합됩니다. 현미경의 포획에서 얻은 몇몇 매개변수는, 그들의 신진 대사 활동 같이 세포의 관련 특징을 처리하기 위하여 상관됩니다. 지금까지, 실라멘트 균주 현탁액에서 펠릿 크기를 측정하기 위해 시투 현미경 프로브 시리즈에 제시되었다. 미세조류 재배에서 단세포 크기를 구별하고 지질 축적과 관련시키기 위해 사용되었다. 세포 입자의 모양은 효모 배양에서 신진과 관련이 있었습니다. 현미경 분석은 일반적으로 세 단계로 분할 될 수있다: (i) 이미지 수집, (ii) 입자 식별, 및 (iii) 데이터 분석, 각각. 모든 단계는 유기체에 적응되어야하며, 따라서 신뢰할 수있는 결과를 달성하기 위해 특정 추가 정보가 필요합니다. 라인 또는 라인(바이패스)에서 세포 형태학의 변화를 직접 모니터링하는 기능을 통해 공정 개발 및 생산 규모에서 모니터링 및 제어를 위한 실시간 값을 구현할 수 있습니다. 오프라인 데이터가 실시간 데이터와 상관 관계가 있는 경우 셀 크기에 대한 알 수 없는 영향을 미치는 현재의 지루한 오프라인 측정은 불필요하게 됩니다.

서론

세포의 형태학적 특징은 종종 생리적 상태와 관련이 있으며, 형태와 기능 사이의 연관성은 많은 응용에 존재한다. 단일 세포의 형태는 성장 상태, 세포의 나이, 삼투성 및 기타 잠재적 인 세포 스트레스 또는 제품 축적에 의해 영향을받습니다. 세포의 형태학적 변화는 종종 배양의 성장 활력의 척도이다. 세포 내 제품 합성, 조류에 지질 축적 및 박테리아에 포함 신체 형성, 다른 사람의 사이에서, 뿐만 아니라 세포 크기와 관련. 세포 응집은 최근 요약 된 바와 같이 조사 가치가 또 다른 요인이 될 수 있습니다².

집단 이질성은 개별 세포의 형태학적 특징에 기초하여 정량화될 수 있다. 연구 결과에 따르면 배양 내의 이질성은 유의할 수 있으며, 예를 들어대규모 생산^조건 3하에서 전체 수율은 하위 모집단^4의낮은 성능에 의해 영향을 받을 수 있습니다.

일반적으로, 세포의 형태학적 특징의 평가는 수동 샘플링 또는 광 광학 장치에 결합된 바이패스 플로우 챔버로 수행된다. 이것은 몇 가지 제한으로 이어진다 : 획득 된 데이터의 제한된 양은 거의 통계적으로 신뢰할 수있는 측....

프로토콜

참고: 다음 단계는 각각의 미생물 및 배양 조건에 매개변수를 적용하는 데 필요하다. 프로브 설정 조정은 숙련된 사용자에게 약 20분 동안 지속됩니다. 도구 및 단계에 대한 자세한 설명은 SOPAT GmbH의 해당 프로브 매뉴얼에 제공됩니다. 일반적으로, 다음 프로토콜에 제시되는 도구가 필요합니다: (i) 프로브 조정 및 이미지 수집을 위한 프로브 컨트롤러; (ii) 획득 한 이미지에 대한 주석피지 (이미지J) ; (iii) 인공 신경망(ANN) 교육 및 워크플로 생성을 위한 SOPAT 지원; (iv) 워크플로우가 있는 이미 획득한 이미지를 사용하여 데이터 배치 처리를 위한 배치; (v) 배치 처리 된 이미지에 대한 결과 시각화 및 평가를위한 결과 분석기; (vi) 자동 실시간 측정 및 결과 시각화를 위한 모니터.

1. 하드웨어 매개 변수 설정

1. 실험 또는 원심분리기 동안 달성될 수 있는 가장 높은 세포 농도로 배양을 준비하고 이 농도를 달성하기 위해 펠릿을 다시 중단한다. 이 경우, 65 g의^L-1의 건조 바이오매스 농축액이 S. 세레비시아 재배를 위해 선택되었다.
2. 예상 범위가 ....

결과

ISM을 사용하여 효모 배양에서 세포 크기 검출을 성공적으로 수행하였고, 신진 세포와 비신진 세포를 구별하기 위한 자동화된 이미지 검출이 성공적으로 수행되었다. 스트로보스코프 강도와 측정 갭의 선택은 모두 입자 식별에 영향을 미치지 않는 허용 오차 범위를 갖습니다. 예를 들어, S. 세레비시아세포는 4 g^L-1의건조한 바이오매스 농도에서 11%의 변이 범위 내에서 다양한 스트로보스코프 강도로 측정하였다. 해당 이미지는 날카로운 셀 경계를 제공하므로 입자 식별은 셀 크기의 허용 가능한 변형 (1%)으로 가능했습니다. 스트로보스코프 강도에 관계없이 스트로보스코프 강도가 제대로 조정되지 않은 경우 이미지가 과도하게 조명되어 적절한 셀 식별이 불가능합니다(그림4).

토론

여기에 제시된 ISM은 동일하거나 매우 유사한 장치로 곰팡이, 미세 조류 및 효모 세포의 형태학적 역학을 측정하는 데 사용되었으며, 이는 성장 활성의 측정을 가능하게 하고, 조류의 경우, 세포내 제품 축적을 가능하게 하였다. 이 센서는 이동식 부품이 없으며 표준 포트를 통해 또는 멸균 가능한 바이패스로 표준 교반 탱크 생물 반응기에 직접 적용할 수 있습니다. 효모는 조류보다 훨씬 작기 때문에, 효모의 충분한 픽셀 분해능을 얻기 위해 셀 크기의 감소는 더 높은 카메라 해상도 및 투과에 의한 조명과 같은 최근의 하드웨어 적응이 필요했습니다(기술적 세부 사항은^15참조). 그러나, 박테리아 같이 더 작은 세포조차 측정을 위한 한계가 아직도 존재합니다. 현장 광 광학 계측의 전류는 UV/VIS 스펙트럼 이하의 구조와 고농도 및 간섭 효과에서 입자 정보가 겹치는 것과 관련된 한계를 나타냅니다. 현재까지 세균 현탁액에 대한 이미지 분석 알고리즘은 밝기 상관 관계

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
센서 MM 2.1 - MFC	SOPAT GmbH, 독일	n.a.Inline	단안 현미경 프로브 버전 2.1 with a Mirco Flow Cell
Sofware version v1R.003.0092	SOPAT GmbH, Germany	n.a.Thickness
gauge	n.n.It		can be any supplier, DIN 2275:2014-03
Ethanol 70%	n.n.It		can be any supplier
SOPAT manual Version 2.0.5	SOPAT GmbH, 독일
광학 렌즈 종이	VWR	470150-460
피지, ImageJ	오픈 소스
50mL 원추형 원심분리기 튜브			모든 공급업체가 될 수 있습니다

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