Bioprintable alginat/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro modellsystem framkalla Cell sfäroid bildas
Summary
Vi utvecklade en heterogen bröst cancer modell bestående av förevigade tumör och fibroblast celler inbäddade i en bioprintable alginat/gelatin bioink. Modellen recapitulates den i vivo tumör närmiljön och underlättar bildningen av flercelliga tumör spheroids, ger inblick i drivkrafterna bakom uppkomst.
Abstract
Den infödda tumör mikromiljö cellulära, biokemiska och biofysiska heterogenitet är inte återgetts av växande förevigade cancer cellinjer med konventionella tvådimensionell (2D) cellodling. Dessa utmaningar kan övervinnas med hjälp av bioprinting tekniker för att bygga heterogena tredimensionella (3D) tumör modeller där olika typer av celler är inbäddade. Alginat och gelatin är två av de vanligaste biomaterial som anställd i bioprinting på grund av deras biokompatibilitet, Biomimetik och mekaniska egenskaper. Genom att kombinera de två polymererna, uppnådde vi en bioprintable sammansatta hydrogel med likheter till mikroskopiska arkitekturen av en infödd tumör stroma. Vi studerade tryckbarhet av sammansatta hydrogel via reologi och fick fönstret för optimal utskrift. Bröstcancerceller och fibroblaster var inbäddade i hydrogels och skrivas ut för att bilda en 3D-modell härma den i vivo mikromiljö. Bioprinted heterogena modellen uppnår en hög lönsamhet för långsiktiga cellkultur (> 30 dagar) och främjar den självmontering av bröstcancerceller i flercelliga tumör spheroids (MCTS). Vi observerade för migration och interaktion av cancer-associerade fibroblast cellerna (CAFs) med MCTS i denna modell. Genom att använda bioprinted cell kultur plattformar som samtidig kultur system, erbjuds här ett unikt verktyg för att studera beroendet av uppkomst på stroma sammansättning. Denna teknik har en hög genomströmning, låg kostnad och hög reproducerbarhet och det kan också ge en alternativ modell till konventionella cellkulturer enskiktslager och djur tumör modeller att studera cancerbiologi.
Introduction
Även om 2D cellkultur används ofta i cancerforskning, finnas begränsningar som cellerna odlas i enskiktslager format med en jämn koncentration av näringsämnen och syre. Dessa kulturer saknar viktig cell-cell och cell-matrix interaktioner finns i den ursprungliga tumören närmiljön (TME). Följaktligen, dessa modeller dåligt recapitulate fysiologiska förhållanden, som leder till avvikande cell beteenden, inklusive onaturliga morfologier, oregelbundna receptor organisation, membran polarisering och avvikande genuttryck, bland annat villkor1,2,3,4. Däremot, erbjuder 3D cellkultur, där cellerna är expanderat i en volymetrisk utrymme som aggregat, spheroids eller organoids, en alternativ teknik för att skapa mer korrekta in vitro- miljöer för att studera grundläggande cellbiologi och fysiologi. 3D cell kultur modeller kan också uppmuntra cell-ECM samspel som är kritiska fysiologiska kännetecken av infödda TME in vitro-1,4,5. Den framväxande 3D bioprinting-tekniken ger möjligheter för att bygga modeller som efterliknar den heterogena TME.
3D bioprinting härleds från prototyper och möjliggör tillverkning av 3D mikrostrukturer som kan härma några av komplexiteten i levande vävnad prover6,7. Den nuvarande bioprinting metoder inkluderar inkjet, extrudering och laser-assisterad utskrift8. Bland dem tillåter metoden extrudering heterogenitet kontrolleras inom de tryckta matriserna genom att exakt Placera olika typer av material på olika ursprungliga platser. Därför är det den bästa metoden att fabricera heterogena i vitro modeller som omfattar flera typer av celler eller matriser. Extrudering bioprinting har framgångsrikt använts för att bygga auricular formade ställningar9, vaskulära strukturer10,11,12, och huden vävnader13, vilket resulterar i hög utskrift trohet och cell lönsamhet. Tekniken har också mångsidig materialval, förmågan att deponera material med celler inbäddade med en känd densitet och hög reproducerbarhet14,15,16,17 . Naturliga och syntetiska hydrogeler används ofta som bioinks för 3D bioprinting på grund av deras biokompatibilitet, bioaktivitet och deras hydrofila nätverk som kan vara konstruerad för att strukturellt likna de ECM7,18 ,19,20,21,22,23. Hydrogeler är också fördelaktigt eftersom de kan innehålla självhäftande platser för celler, strukturella element, permeabilitet för näringsämnen och gaser och lämpliga mekaniska egenskaper att uppmuntra cell utveckling24. Till exempel, erbjuda kollagen hydrogels integrin anchorage platser som celler kan använda för att fästa till matrisen. Gelatin, denaturerat kollagen, behåller liknande cell adhesion webbplatser. Däremot alginat är bioinert men ger mekanisk integritet genom att bilda antipyridinantikropp med tvåvärda joner25,26,27,28.
I detta arbete utvecklat vi en sammansatt hydrogel som en bioink, består av alginat och gelatin, med likheter till mikroskopiska arkitekturen av en infödd tumör stroma. Bröstcancerceller och fibroblaster var inbäddad i hydrogels och skrivas ut via en extrudering-baserade bioprinter för att skapa en 3D-modell som efterliknar den i vivo mikromiljö. Bakåtkompilerade 3D miljön tillåter cancerceller att bilda flercelliga tumör spheroids (MCTS) med en hög lönsamhet under långa perioder av cellkultur (> 30 dagar). Detta protokoll visar metoderna av syntetisera sammansatta hydrogels, karakterisera materialen mikrostruktur och tryckbarhet, bioprinting cellulära heterogena modeller, och observera bildandet av MCTS. Dessa metoder kan tillämpas på andra bioinks i extrudering bioprinting samt om olika designer av heterogen vävnad modeller med potentiella tillämpningar i drogkontroll, cell migration analyser och studier som fokuserar på grundläggande cell fysiologiska funktioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cell-lastad strukturer kan äventyras om kontaminering (biologisk eller kemisk) sker vid något tillfälle i processen. Vanligt, biologisk förorening ses efter två eller tre dagar av kultur som en färg förändrad kultur media eller bioprinted struktur. Sterilisering (fysisk och kemisk desinfektion) är därför ett viktigt steg för alla cell-relaterade processer. Anmärkningsvärd, autoklavering gelatin ändras dess gelbildande egenskaper, vilket gjorde det gel långsammare i de studier vi genomfört. Därför steri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tao Jiang tack Kina stipendium rådet (201403170354) och McGill Engineering forskarutbildning Award (90025) för sin stipendium finansiering. Jose G. Munguía-Lopez tack CONACYT (250279, 290936 och 291168) och FRQNT (258421) för sin stipendium finansiering. Salvador Flores-Torres tack CONACYT för deras stipendium finansiering (751540). Joseph M. Kinsella tack National Science och Engineering Research Council, det kanadensiska Institutet för Innovation, Townshend-Lamarre Family Foundation och McGill University för sin finansiering. Vi vill tacka Allen Ehrlicher för att tillåta oss att använda hans reometer, Dan Nicolau för att tillåta oss att använda hans confocal mikroskopet, och Morag Park för att bevilja oss tillgång till fluorescently märkt cellinjer.
Materials
| Sodium alginate | FMC BioPolymer | CAS-No: 9005-38-3 | Protanal LF 10/60 FT |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B gelatin from bovine skin |
| Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X) | Gibco | LS14190136 | 1×, w/o calcium, w/o magnesium |
| Magnetic hotplate | Corning | N/A | Stirrer/hot plate model PC-420 |
| 50 mL centrifuge tubes | Corning | 352098 | Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile |
| Centrifuge | GMI | N/A | Sorvall RT6000D, GMI, USA |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| MilliQ water | Millipore | N/A | |
| Millipore 0.22 µm filters | Millipore | SLGS033SB | Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized |
| Oscillation rheometer MCR 302 | Anton Paar | N/A | |
| Rheometer measuring tool CP25 | Anton Paar | 79038 | Conical plate geometry for rheometer |
| RheoCompass | Anton Paar | N/A | Software controlling rheometer MCR 302 |
| Scanning electron microscope | Hitachi | N/A | SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure |
| Paraformaldehyde, 96%, extra pure | Acros Organics | 416785000 | |
| Dulbecco modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | |
| Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized | Sigma | A5955 | |
| Fetal bovine serum | Wisent Bioproducts | 080-150 | |
| Cell culture T-75 flasks | Sigma-Aldrich | CLS430641 | 75 cm2 TC-Treated surface treatment |
| 3D bioprinter BioScaffolder 3.1 | GeSiM | N/A | |
| GeSim software | GeSiM | N/A | Software controlling BioScaffolder 3.1 |
| 10cc cartridge UV resist | EFD Nordson | 7012126 | |
| End cap | EFD Nordson | 7014472 | |
| Tip cap | EFD Nordson | 7014469 | |
| Piston | EFD Nordson | 7012182 | |
| Stainless nozzle G25 | EFD Nordson | 7018345 | |
| Water bath | VWR | N/A | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Bioreagent, for molecular biology |
| Costar 6-well plates | Corning | 3516 | TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile |
| Confocal spinning disk inverted microscope | Olympus Life Science | N/A | Olympus IX83 |
| MTS assay kit | Promega | G3582 | CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay |
| Live/Dead viability cytotoxicity kit | Molecular Probes,ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Trypsin 0.25/EDTA 1X | Gibco | 25200-072 | |
| Corning 96-well plate | Corning | 3595 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile |
| Autoclave Tuttnauer | Heidolph Brinkmann | N/A | Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
| Ethanol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Greenfield Speciality Alcohols |
| CO2 Incubator | Panasonic | N/A | MCO 19AIC-PA |
| Lyophilizer | SP Scientific | N/A | Virtis Sentry 2.0 |
| SolidWorks | Dassault Systems | N/A | A CAD software used to build demostrative propeller-like model |
| MATLAB | The MathWorks | N/A | A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1 |
References
- Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14 (127), (2017).
- Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (3), 327-332 (2013).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. The relevance of using 3D cell cultures, in addition to 2D monolayer cultures, when evaluating breast cancer drug sensitivity and resistance. Oncotarget. 7 (29), 45745-45756 (2016).
- Yue, X., Lukowski, J. K., Weaver, E. M., Skube, S. B., Hummon, A. B. Quantitative proteomic and phosphoproteomic comparison of 2D and 3D colon cancer cell culture models. Journal of Proteome Research. 15 (12), 4265-4276 (2016).
- Priwitaningrum, D. L., et al. Tumor stroma-containing 3D spheroid arrays: a tool to study nanoparticle penetration. Journal of Controlled Release. 244 (Pt B), 257-268 (2016).
- Hong, S., et al. Cellular behavior in micropatterned hydrogels by bioprinting system depended on the cell types and cellular interaction. Journal of Bioscience and Bioengineering. 116 (2), 224-230 (2013).
- Dolati, F., et al. In vitro evaluation of carbon-nanotube-reinforced bioprintable vascular conduits. Nanotechnology. 25 (14), 145101 (2014).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
- Kang, H. W., et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity. Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
- Jia, W., et al. Direct 3D bioprinting of perfusable vascular constructs using a blend bioink. Biomaterials. 106, 58-68 (2016).
- Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).
- Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (6), 473-484 (2014).
- Jiang, T., et al. Directing the self-assembly of tumour spheroids by bioprinting cellular heterogeneous models within alginate/gelatin hydrogels. Scientific Reports. 7 (1), 4575 (2017).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
- Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
- Nair, K., et al. Characterization of cell viability during bioprinting processes. Biotechnology Journal. 4 (8), 1168-1177 (2009).
- Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
- Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001 (2014).
- Ling, K., et al. Bioprinting-based high-throughput fabrication of three-dimensional MCF-7 human breast cancer cellular spheroids. 공학. 1 (2), 269-274 (2015).
- Liang, Y., et al. A cell-instructive hydrogel to regulate malignancy of 3D tumor spheroids with matrix rigidity. Biomaterials. 32 (35), 9308-9315 (2011).
- Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. 3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels. Biomaterials. 32 (31), 7905-7912 (2011).
- Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
- Hospodiuk, M., Dey, M., Sosnoski, D., Ozbolat, I. T. The bioink: a comprehensive review on bioprintable materials. Biotechnology Advances. 35 (2), 217-239 (2017).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Bhutani, U., Laha, A., Mitra, K., Majumdar, S. Sodium alginate and gelatin hydrogels: viscosity effect on hydrophobic drug release. Materials Letters. 164, 76-79 (2016).
- Biswal, D., et al. Effect of mechanical and electrical behavior of gelatin hydrogels on drug release and cell proliferation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 53, 174-186 (2016).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. I. Structural investigation. Journal de Physique (France). 49 (2), 319-332 (1988).
- Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. II. Rheology of the sol-gel transition. Journal de Physique (France). 49 (2), 333-343 (1988).
- Coussot, P. . Rheometry of Pastes, Suspensions, and Granular Materials: Applications in Industry and Environment. , (2005).
- Ouyang, L., Yao, R., Zhao, Y., Sun, W. Effect of bioink properties on printability and cell viability for 3D bioplotting of embryonic stem cells. Biofabrication. 8 (3), 035020 (2016).
- Michon, C., Cuvelier, G., Launay, B. Concentration dependence of the critical viscoelastic properties of gelatin at the gel point. Rheologica Acta Rheologica Acta: An International Journal of Rheology. 32 (1), 94-103 (1993).
- Mouser, V. H., et al. Yield stress determines bioprintability of hydrogels based on gelatin-methacryloyl and gellan gum for cartilage bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 035003 (2016).
- Benbow, J. J., Oxley, E. W., Bridgwater, J. The extrusion mechanics of pastes-the influence of paste formulation on extrusion parameters. Chemical Engineering Science. 42 (9), 2151-2162 (1987).
- Bingham, E. C. . Fluidity and plasticity. , (1922).
- Horrobin, D. J., Nedderman, R. M. Die entry pressure drops in paste extrusion. Chemical Engineering Science. 53 (18), 3215-3225 (1998).
- Soman, P., et al. Cancer cell migration within 3D layer-by-layer microfabricated photocrosslinked PEG scaffolds with tunable stiffness. Biomaterials. 33 (29), 7064-7070 (2012).
- Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Akasov, R., et al. Formation of multicellular tumor spheroids induced by cyclic RGD-peptides and use for anticancer drug testing in vitro. International Journal of Pharmaceutics. 506 (1-2), 148-157 (2016).
