परिधीय रूप से जुड़े प्रोटीन के लिए प्लाज्मा झिल्ली विभाजन का निर्धारण
Summary
यहां, हम एक के लिए प्लाज्मा-झिल्ली एसोसिएशन के स्तर की एक मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए प्रस्तुत फ्लोरोसेंट-बाह्य टैग के लिए-परिधीय जुड़े प्रोटीन । विधि झिल्ली और cytoplasmic घटक के संकेत की गणना अपघटन पर आधारित है प्लाज्मा झिल्ली फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ लेबल कोशिकाओं में मनाया ।
Abstract
इस पद्धति प्लाज्मा झिल्ली के पार प्रतिदीप्ति तीव्रता की प्रोफाइल का उपयोग कर किसी भी फ्लोरोसेंट-टैग की गई बाह्य परिधीय-संबंधित प्रोटीन का निर्धारण के लिए एक तेजी से दृष्टिकोण प्रदान करता है । मापा प्रतिदीप्ति प्रोफाइल एक लाइन के साथ झिल्ली और कोशिका द्रव्य प्रतिदीप्ति वितरण के लिए एक मॉडल द्वारा सज्जित कर रहे है सीधा सेल परिधि के लिए लागू किया । इस मॉडल के संदर्भ कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों से निर्मित है कोशिका द्रव्य के लिए एक फ्लोरोसेंट-टैग मार्कर और एफएम 4-64 के साथ-प्लाज्मा झिल्ली लेबल व्यक्त । विधि विभिंन प्रकार के सेल और जीवों के लिए लागू किया जा सकता है; हालांकि, गैर-पड़ोसी कोशिकाओं के केवल प्लाज्मा झिल्ली का मूल्यांकन किया जा सकता है । यह तेजी से माइक्रोस्कोपी आधारित विधि प्रयोगों के लिए उपयुक्त है, जहां प्लाज्मा झिल्ली के सूक्ष्म और गतिशील परिवर्तन-जुड़े मार्करों की उम्मीद है और quantified होने की जरूरत है, उदाहरणके लिए, प्रोटीन के उत्परिवर्ती संस्करणों के विश्लेषण में, अवरोध करनेवाला उपचार, आणि सिग्नल transduction प्रेक्षणे आहेत. विधि एक बहु-प्लेटफ़ॉर्म R पैकेज जो एक उपयोगकर्ता के अनुकूल इंटरफ़ेस के रूप में कार्य करता है एक ImageJ मैक्रो के साथ युग्मित है में लागू किया गया है ।
Introduction
परिधीय-संबंधित प्लाज्मा-झिल्ली प्रोटीन सेल संकेत मार्ग के प्रमुख घटक हैं । उनके मौलिक भूमिकाओं में से एक है उनके क्षणिक प्लाज्मा झिल्ली एसोसिएशन और पृथक्करण, जो प्लाज्मा झिल्ली और कोशिका द्रव्य के बीच संकेत transduction के लिए महत्वपूर्ण है. परिधीय-संबंधित प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन लिपिड लंगर द्वारा प्लाज्मा झिल्ली पर संलग्न किया जा सकता (एन-myristoylation, एस-acylation, या prenylation) या लिपिड बाध्यकारी डोमेन द्वारा (phosphatidylinositol फॉस्फेट, phosphatidic एसिड के साथ बातचीत, आदि) ।
इन प्रोटीन के प्लाज्मा झिल्ली बाध्यकारी गुण vivo मेंजांच की जा सकती है, उदाहरणके लिए, जब एक फ्लोरोसेंट-टैग प्रोटीन एक साइट द्वारा संशोधित किया गया है कुंजी अमीनो एसिड का निर्देश mutagenesis, या जब यह विभिंन अवरोधकों के साथ व्यवहार किया जाता है प्रभावित लिपिड सिग्नलिंग. परिधीय प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के वितरण ज्यादातर गुणात्मक मूल्यांकन किया जा रहा है, विशेष रूप से मामलों में, जब प्रोटीन पुनः वितरण स्पष्ट है । प्रस्तुत विधि स्थितियों के लिए इष्टतम है जब प्रोटीन पुनः वितरण केवल आंशिक और मात्रात्मक मूल्यांकन आवश्यक है । के एक बार इस्तेमाल किया दृष्टिकोण जब प्लाज्मा झिल्ली एसोसिएशन से अनुमान है फोकल लेजर प्लाज्मा में प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुपात के रूप में माइक्रोस्कोपी छवियों स्कैनिंग-झिल्ली और कोशिका द्रव्य1,2में, सरल है, लेकिन नहीं सटीक. प्लाज्मा झिल्ली में प्रतिदीप्ति तीव्रता विशेष प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपिक तकनीक और ऑप्टिकल तत्वों के लिए प्रकाश विवर्तन विशेषता के कारण प्लाज्मा-झिल्ली और कोशिका द्रव्य संकेत के एक superposition को प्रतिबिंबित3। नतीजतन, cytoplasmic संकेत झिल्ली क्षेत्र में भी शामिल है । इस कारण से, एफएम 4-64 धुंधला पैटर्न एक झिल्ली संकेत चयन4के लिए एक मुखौटा के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता । इसके अलावा, एफएम 4-64 धुंधला अधिकतम द्वारा परिभाषित स्थिति पर झिल्ली संकेत की सरल माप हमेशा व्यवस्थित रूप से से जुड़े प्लाज्मा-झिल्ली प्रोटीन के superposition के कारण की वास्तविक प्लाज्मा-झिल्ली संकेत का अनुमान लगाना झिल्ली और cytoplasmic यौगिक । के लिए देखा संकेतों की अधिकतम फ्लोरोसेंट-टैग की गईं बाह्य उपकरणों से जुड़े प्रोटीन भी सह नहीं करता है प्लाज्मा झिल्ली मार्कर (यानी, एफएम 4-64 styryl डाई) की अधिकतम के साथ, लेकिन कोशिका द्रव्य की ओर स्थानांतरित कर दिया है । एक और सीमा तथ्य यह है कि एफएम 4-64 उत्सर्जन चोटी इस तरह के रूप में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए उत्सर्जन चोटियों के साथ तुलना में व्यापक है पर आधारित है GFP तरंग दैर्ध्य-प्रकाश विवर्तन3की निर्भरता के कारण ।
यहां वर्णित विधि में, चिह्नित प्रोटीन संकेत दो अनुभवजंय प्लाज्मा झिल्ली और कोशिका द्रव्य संकेत, क्रमशः के एक काल्पनिक वितरण का वर्णन कार्यों से सज्जित है । यह संकेत अपघटन रैखिक प्रतिदीप्ति प्रोफाइल है कि स्रोत छवियों, जो नियमित रूप से कर रहे है में प्लाज्मा झिल्ली को सीधा सेल सतह पर लागू कर रहे है करने के लिए लागू किया जाता है, दो चैनल के फोकल वर्गों फ्लोरोसेंट-टैग प्रोटीन व्यक्त एफएम 4-64 डाई के साथ लेबल कोशिकाओं ।
फिटिंग के लिए इस्तेमाल किया पहला समारोह सेल एज पर एक कोशिका द्रव्य संकेत के एक विवर्तन का वर्णन करता है । यह पहले से प्राप्त की है प्रतिदीप्ति प्रोफाइल है कि एक कोशिका द्रव्य प्रोटीन प्लाज्मा झिल्ली के रूप में एक ही chromophore द्वारा टैग मार्करों को व्यक्त की कोशिकाओं में मापा गया है परिधीय-ब्याज के जुड़े प्रोटीन । दूसरा समारोह एक प्लाज्मा-झिल्ली संकेत के एक विवर्तन का वर्णन एफएम 4-64 के प्रतिदीप्ति से ली गई है । यह संकेत सबसे पहले एक गाऊसी समारोह है कि एक बिंदु स्रोत के प्रकाश विवर्तन के एक अनुमानित मॉडलिंग के लिए इस्तेमाल किया जा रहा द्वारा अनुमानित है । दूसरे, इस मॉडल, लाल एफएम 4-64 उत्सर्जन के लिए मांय है, गणितीय रूप है कि chromophore के एक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के लिए प्रासंगिक प्लाज्मा झिल्ली में रुचि के परिधीय-संबद्ध प्रोटीन की टैगिंग के लिए प्रयोग किया जाता है के लिए उपयुक्त है बदल गया है । दोनों कार्यों को अधिकतम तीव्रता से और एफएम 4-64 संकेत और cytoplasmic प्रोटीन संकेत, क्रमशः के लिए उच्चतम मूल्यों का 10% से मतलब द्वारा सामान्यीकृत हैं । इस संकेत अपघटन द्वारा (गैर रेखीय कम वर्ग फिटिंग विधि), प्लाज्मा झिल्ली के अनुपात और जांच प्रोटीन के कोशिका द्रव्य अंश आसानी से और सही अनुमान लगाया जा सकता है । गणना विभाजन गुणांक के वास्तविक भौतिक आयाम माइक्रोमीटर की श्रेणी में है, क्योंकि cytoplasmic मात्रा एकाग्रता प्लाज्मा झिल्ली पर सतह एकाग्रता के साथ तुलना में है । यह कोशिका द्रव्य के लिए प्लाज्मा झिल्ली से दूरी को परिभाषित करता है, जिसके भीतर प्रोटीन की एक ही राशि प्लाज्मा झिल्ली के आसन्न क्षेत्र में के रूप में स्थानीयकृत है । यह मान विभाजन गुणांक K2 पहले5पेश करने के लिए समतुल्य है । विधि बहुत जल्दी है, केवल एक ही फोकल वर्गों नियमित फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर अधिग्रहीत की आवश्यकता होती है, और यह गणना की मांग नहीं है । विश्लेषण कोर एक पोर्टेबल R पैकेज में लागू किया गया है और एक अतिरिक्त ImageJ मैक्रो विश्लेषण सहज ज्ञान युक्त संवाद से चलाने के लिए ग्राफ़िकल यूज़र इंटरफ़ेस प्रदान करने के लिए लिखा गया था । सॉफ्टवेयर और विधि का अधिक विस्तृत विवरण (पहले6प्रकाशित) http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/पर पाया जा सकता है ।
विधि पृथक कोशिकाओं के लिए उपयुक्त है, protoplasts, और ऊतकों, जहां व्यक्तिगत कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली स्पष्ट रूप से अलग है, एक फ्लोरोसेंट-टैग व्यक्त की जांच की परिधीय रूप से जुड़े प्रोटीन का निर्माण । एक एफएम 4-64 धुंधला के साथ संगत chromophore इस्तेमाल किया जाना चाहिए । एफएम 4-64 लाल प्रतिदीप्ति उत्सर्जन करता है; इसलिए, प्रोटीन की जांच की, नीले, हरे या पीले उत्सर्जन के साथ एक प्रतिदीप्ति प्रोटीन द्वारा टैग किया जा सकता है (जैसे, GFP,, YFP) । जैविक सामग्री के स्थिर परिवर्तन की सिफारिश की है क्योंकि यह प्रोटीन वितरण के कम कृत्रिम और अधिक reproducible टिप्पणियों को सक्षम बनाता है । यह आवश्यक है कि जांच प्रोटीन एक अपेक्षाकृत सजातीय cytoplasmic वितरण किया है । endoplasmic जालिका या अंय intracellular झिल्ली डिब्बे में एक प्रोटीन का स्थानीयकरण कृत्रिम परिणाम उत्पादन कर सकते हैं ।
इसके अतिरिक्त, एक ही जैविक सामग्री एक cytoplasmic मार्कर व्यक्त तुलना के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । कोशिकाओं को एक मुक्त chomophore द्वारा रूपांतरित किया जा सकता है (परिधीय प्रोटीन टैगिंग के लिए इस्तेमाल के रूप में ही, जैसे, मुक्त GFP) या द्वारा समाप्त झिल्ली बाध्यकारी क्षमता के साथ ब्याज की टैग प्रोटीन । झिल्ली बाध्यकारी क्षमता को समाप्त किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, झिल्ली की छंटनी द्वारा-बाध्यकारी डोमेन या साइट द्वारा निर्देशित mutagenesis कुंजी एमिनो एसिड residua के (जैसे, एन के लिए साइटें-myristoylation, S-acylation, या prenylation, आदि) ।
फोकल स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के लिए, कोशिकाओं एफएम 4-64 डाई की तरह एक झिल्ली मार्कर से लेबल किया जाना चाहिए. यदि एफएम 4-64 धुंधला अध्ययन सामग्री के लिए उपयुक्त नहीं है (autofluorescence हस्तक्षेप, गरीब डाई प्रवेश, आदिके कारण), प्लाज्मा झिल्ली उदाहरण के लिए, लेबल किया जा सकता है, अभिंन प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन द्वारा एक उपयुक्त chomophore के लिए टैग ( mCherry, आरएफपी, आदि) । यह मार्कर intracellular झिल्ली डिब्बों (endomembranes) में नगण्य स्थानीयकरण है कि आवश्यक है.
यदि निश्चित नमूनों और एंटीबॉडी के साथ काम करना, fixable एनालॉग एफएम 4-64FX या प्लाज्मा झिल्ली लेबलिंग एंटीबॉडी द्वारा एक उचित लक्ष्य के खिलाफ इस्तेमाल किया जा सकता है । इस मामले में, यह बहुत सावधानी से परिणाम का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक है क्योंकि निर्धारण प्रक्रियाओं कोशिका द्रव्य और प्लाज्मा झिल्ली दोनों से प्रोटीन के चयनात्मक नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
विधि यहां वर्णित प्रतिदीप्ति तीव्रता5मापने के आधार पर अन्य दृष्टिकोण की तुलना में परिधीय रूप से जुड़े प्रोटीन के लिए प्लाज्मा झिल्ली विभाजन का एक और अधिक सटीक आकलन उत्पन्न करता है. इस विधि का …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना NPU मैं, LO1417 (शिक्षा, युवा और चेक गणराज्य के खेल मंत्रालय) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| FM 4-64 | ThermoFisher Scientific | T13320 | Plasma membrane dye |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 Sigma | Dye solvent |
| Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes) | Equipment for cell labelling and microscopy | ||
| Confocal laser scanning microscope | |||
| Ordinary computer |
References
- Barbosa, I. C. R., Shikata, H., Zourelidou, M., Heilmann, M., Heilmann, I., Schwechheimer, C. Phospholipid composition and a polybasic motif determine D6 PROTEIN KINASE polar association with the plasma membrane and tropic responses. Development. 143 (24), 4687-4700 (2016).
- Kato, M., Aoyama, T., Maeshima, M. The Ca2+-binding protein PCaP2 located on the plasma membrane is involved in root hair development as a possible signal transducer. Plant J. 74 (4), 690-700 (2013).
- Kubitscheck, U. . Fluorescence Microscopy: From Principles to Biological Applications. , (2013).
- Janecki, A. J., Janecki, M., Akhter, S., Donowitz, M. Quantitation of plasma membrane expression of a fusion protein of Na/H exchanger NHE3 and green fluorescence protein (GFP) in living PS120 fibroblasts. J Histochem Cytochem. 48 (11), 1479-1492 (2000).
- Peitzsch, R. M., McLaughlin, S. Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins. 생화학. 32 (39), 10436-10443 (1993).
- Vosolsobě, S., Petrášek, J., Schwarzerová, K. Evolutionary plasticity of plasma membrane interaction in DREPP family proteins. Biochim Biophys Acta – Biomembr. 1859 (5), 686-697 (2017).
- Bolte, S., Talbot, C., Boutte, Y., Catrice, O., Read, N. D., Satiat-Jeunemaitre, B. FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. J Microsc. 214 (2), 159-173 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Development Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
- Logan, D. C., Domergue, O., Teyssendier de la Serve, B., Rossignol, M. A new family of plasma membrane polypeptides differentially regulated during plant development. Biochem Mol Biol Int. 43 (5), 1051-1062 (1997).
- Ide, Y., Nagasaki, N., Tomioka, R., Suito, M., Kamiya, T., Maeshima, M. Molecular properties of a novel, hydrophilic cation-binding protein associated with the plasma membrane. J Exp Bot. 58 (5), 1173-1183 (2007).
- Nagasaki-Takeuchi, N., Miyano, M., Maeshima, M. A plasma membrane-associated protein of Arabidopsis thaliana AtPCaP1 binds copper ions and changes its higher order structure. J Biochem. 144 (4), 487-497 (2008).
- Li, J., et al. MDP25, A Novel Calcium Regulatory Protein, Mediates Hypocotyl Cell Elongation by Destabilizing Cortical Microtubules in Arabidopsis. Plant Cell. 23 (12), 4411-4427 (2011).
- Qin, T., Liu, X., Li, J., Sun, J., Song, L., Mao, T. Arabidopsis microtubule-destabilizing protein 25 functions in pollen tube growth by severing actin filaments. Plant Cell. 26 (1), 325-339 (2014).
- Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 Cell Line as the "HeLa" Cell in the Cell Biology of Higher Plants. Int Rev Cytol. 132, 1-30 (1992).
- Hellens, R. P., Anne Edwards, E., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: A versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol Biol. 42 (6), 819-832 (2000).
- Vermeer, J. E. M., Thole, J. M., Goedhart, J., Nielsen, E., Munnik, T., Gadella, T. W. J. Imaging phosphatidylinositol 4-phosphate dynamics in living plant cells. Plant J. 57 (2), 356-372 (2009).
- Laňková, M., et al. Determination of Dynamics of Plant Plasma Membrane Proteins with Fluorescence Recovery and Raster Image Correlation Spectroscopy. Microsc Microanal. 22 (2), 290-299 (2016).
