In Vivo Nanovector livraison d’une coeur spécifiques microARN-éponge
Summary
L’inhibition spécifique des tissus micro-ARN est une technologie qui est sous-développé dans le domaine des micro-ARN. Ici, nous décrivons un protocole pour empêcher avec succès la famille miR-181 micro-ARN dans des cellules myoblastiques du cœur. Technologie Nanovector est utilisée pour livrer un microARN éponge illustrant l’importante en vivo cardio spécifique miR-181 famille inhibition.
Abstract
MicroARN (miARN) est petit non codant l’ARN qui inhibe l’expression post-transcriptionnelle ARN messager (ARNm). Des maladies humaines, comme le cancer et les maladies cardiovasculaires, ont été démontrés pour activer des tissus et/ou spécifiques des cellules miRNA expression associée à la progression de la maladie. L’inhibition de l’expression de miRNA offre la possibilité d’une intervention thérapeutique. Cependant, les approches traditionnelles d’inhiber les miARN, utilisant des oligonucléotides antagomir, affectent miRNA spécifiques fonctions lors de la livraison mondiale. Ici, nous présentons un protocole pour l’inhibition in vivo cardio spécifique de la famille de miR-181 dans un modèle de rat. Une construction de miRNA-éponge est conçue pour inclure les 10 séquences répétées de liaison anti-pré-Mir-181. Le promoteur de cardio propres α-MHC est cloné dans l’épine dorsale de pEGFP pour conduire l’expression spécifique cardio miR-181 miRNA-éponge. Pour créer une cellule stable lignée exprimant le miR-181-éponge, les myoblastes H9c2 cellules est transfectée avec la construction de α-MHC-EGFP-miR-181-sponge et triée par cellule activée par fluorescence (FACs) de tri en cellules H9c2 positives de GFP, qui sont cultivées avec la néomycine (G418). Suite à une croissance stable à la néomycine, populations de cellules monoclonales sont établies par FACs supplémentaires et le clonage de cellules du même. Les cellules de H9c2-miR-181-éponge-GFP de myoblastes qui en résulte présentent une perte de fonction des membres de la famille miR-181 tel qu’évalué par le biais de l’augmentation de l’expression des protéines cibles miR-181 et par rapport aux cellules H9c2 exprimant une éponge non-fonctionnel scramble. En outre, nous développons un nanovector pour la délivrance systémique de la construction de miR-181-éponge par complexation chargés positivement les nanoparticules liposomales et chargés négativement les plasmides de miR-181-éponge. L’imagerie in vivo de GFP révèle que les injections multiples de queue veineuse d’une nanovector sur une période de trois semaines sont capables de promouvoir une expression significative de la miR-181-éponge dans une manière spécifique cardio. Ce qui est important, une perte de fonction de miR-181 est observée dans le tissu cardiaque, mais pas dans les reins ou le foie. L’éponge-miRNA est une méthode puissante pour inhiber l’expression tissu-spécifique miRNA. L’expression de miRNA-éponge au volant d’un promoteur spécifique aux tissus fournit la spécificité pour l’inhibition de miRNA, qui peut se limiter à un organe ciblé ou un tissu. En outre, combinant les technologies nanovector et miRNA-éponge permet une livraison efficace et spécifique des tissus miRNA inhibition in vivo.
Introduction
Au cours des deux dernières décennies, il y a eu de nombreuses études qui ont souligné le rôle important des miARN dans la maladie humaine. Résultats d’un vaste corpus de littérature démontrent l’importance indéniable des miARN dans la physiopathologie des maladies comme le cancer1 et maladies cardiovasculaires2,3,4,5. Par exemple, miR-21 est augmenté dans nombreux cancers, ce qui entraîne une prolifération accrue cycle cellulaire et la cellule6. Dans les infections de virus de l’hépatite C, miR-122 joue un rôle important dans la réplication du virus7, et il a été démontré que l’inhibition de miR-122 diminue la charge virale8. Dans l’hypertrophie cardiaque, miR-212/132 est augmentée dans le cœur et est impliqué dans le phénotype pathologique9. L’importance évidente de la diminution de l’expression ou l’inhibition fonctionnelle d’un miRNA surexprimés suggère des possibilités d’exploitation thérapeutique de la biologie de miRNA dans presque toutes les maladies.
Les quatre membres de famille miR-181, miR-181 a/b/c/d, sont trouvent dans trois sites génomiques dans le génome humain. La région intronic d’un gène du hôte d’ARN non codants (MIR181A1-HG) encode le cluster de miR-181-a/b-1. La région intronic du gène NR6A1 encode le miR-181-a/b-2. Le cluster de miR-181-c/d se trouve dans un relevé de notes non caractérisé sur le chromosome 19. Tous les membres de la famille miR-181 partagent la même séquence de « semences » et tous les quatre membres de famille miR-181 peuvent potentiellement réguler les mêmes objectifs d’ARNm.
Nous avons3,4 et autres10 ont mis en évidence l’importance de miR-181 membres de la famille au cours de l’insuffisance cardiaque terminale. Nous avons également reconnu qu’une upregulation de miR – 181c se produit dans des conditions pathologiques associées à un risque accru de maladie cardiaque, tels que diabète de type II, obésité et vieillissement3,4,5. Il a été postulé que la surexpression de miR – 181c cause un stress oxydatif qui mène à une dysfonction cardiaque4.
Plusieurs groupes ont suggéré que miRNA existent dans les mitochondries11,12,13,14, mais nous avons été les premiers à démontrer que miR – 181 c est dérivé le génome nucléaire, traité, et par la suite déplacés vers les mitochondries dans le RISC3. En outre, nous avons détecté une faible expression de miR-181 et miR-181 dans le compartiment mitochondrial du cœur5. Ce qui est important, nous trouvons que miR – 181c réprime l’expression de l’ARNm mt-COX1, démontrant ainsi que les miARN participe à la régulation du gène mitochondrial et altérer la fonction mitochondriale3,4.
Cet article décrit la méthodologie requise pour concevoir une miRNA-éponge d’abattre toute la famille de miR-181 dans les cardiomyocytes. En outre, nous exposons un protocole pour l’application in vivo de le miR-181-éponge.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit la conception et la synthèse d’une éponge-miRNA et démontré comment l’expression tissu-spécifique de l’éponge est un outil puissant pour inhiber les famille expression tissu-spécifique miRNA.
Nous avons démontré qu’une famille de miR-181 ciblant l’éponge peut être clonée dans un plasmide d’expression avec un promoteur spécifique cardiaque. Le plasmide peut être efficacement empaqueté dans une particule nanovector pour livraison in vitro e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Anthony K. L. Leung du département de biochimie et de biologie moléculaire, Bloomberg School of Public Health, Université de Johns Hopkins pour sa technique aide à la conception de la construction de miR-181-éponge. Nous remercions également Polina Sysa-Shah et Kathleen Gabrielson du département de moléculaire et biopathologie comparée, Johns Hopkins Medical Institutions pour leur assistance technique de l’imagerie in vivo de la livraison de miRNA-éponge.
Ce travail a été soutenu par des subventions de la NIH, HL39752 (à Charles Steenbergen) et par une subvention de développement scientifique de l’American Heart Association 14SDG18890049 (pour Samarjit Das). Le promoteur de cardio spécifique de rat a été généreusement fourni par Jeffery D. Molkentin, hôpital pour enfants Cincinnati.
Materials
| pEGFP-C1 vector | Addgene | 6084-1 | |
| In-fusion | Clontech | 121416 | |
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| miR-181-sponge synthesis | Introgen GeneArt | custome made | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | custome | |
| EcoRI enzymes | New Endland Biolabs | R0101S | |
| KpnI enzymes | New Endland Biolabs | R0142S | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Sigma-Aldrich | 11635379001 | |
| H9c2 cells | ATCC | CRL-1446 | |
| DMEM Media | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) | Lonza | VCA-1005 | |
| G418, Geneticin | Thermo Fisher Scientific | 11811023 | |
| FACSAria II Flow cytometer | BD Bioscience | 644832 | |
| Branson 450 sonifier | Marshall Scientific | EDP 100-214-239 | |
| The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device | Caliper Life Sciences | ||
| Anti-MTCO1 antibody | Abcam | ab14705 | |
| α-tubulin antibody | Abcam | ab7291 | |
| Sequoia C256 ultrasound system | Siemens |
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