אין ויוו Nanovector מסירת MicroRNA ספציפי הלב-ספוג
Summary
עיכוב רקמות ספציפיות microRNA היא טכנולוגיה זה לא מפותח בתחום microRNA. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול לעכב ממשפחת מיר-181 microRNA בתאים myoblast בהצלחה מכל הלב. טכנולוגיית Nanovector משמש כדי לספק microRNA ספוג המדגים משמעותי ויוו אירובי ספציפיים מיר-181 משפחה עיכוב.
Abstract
MicroRNA (miRNA) הוא קטן ללא קידוד RNA אשר מעכב את הביטוי post-transcriptional RNA שליח (mRNA). מחלות אנושיות, כגון סרטן, מחלות לב וכלי דם, הוכחו להפעיל רקמות ו/או ביטוי miRNA תא ספציפיים הקשורים עם התקדמות המחלה. עיכוב של הביטוי miRNA מציע את פוטנציאל התערבות טיפולית. עם זאת, הגישות המסורתיות לעכב miRNAs, העסקת antagomir oligonucleotides, להשפיע על פונקציות ספציפיות miRNA במסירה גלובלית. במסמך זה, אנו מציגים עבור ויוו אירובי ספציפיים עיכוב של משפחת מיר-181 פרוטוקול במודל של עכברים. מבנה miRNA-הספוג נועד לכלול 10 רצפים חוזרים ונשנים איגוד אנטי-miR-181. יזם סיבולת לב ריאה ספציפיים α-MHC שוכפל לתוך עמוד השדרה pEGFP לנהוג הביטוי אירובי ספציפיים מיר-181 miRNA-ספוג… כדי ליצור תא יציב קו לבטא את מיר-181-ספוג, תאים H9c2 myoblast transfected עם הבונה α-MHC-EGFP-miR-181-sponge וממויינות לפי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACs) לתוך תאים H9c2 חיובי GFP אשר מתורבתים עם neomycin (G418). בעקבות צמיחת יציב neomycin, תא monoclonal אוכלוסיות הנקבעים על-ידי FACs נוספים, שיבוט תא בודד. התאים H9c2-מיר-181-ספוג-GFP myoblast וכתוצאה מכך נספח אובדן התפקוד של בני משפחתו מיר-181 כפי העריך דרך ביטוי מוגבר של חלבונים היעד מיר-181, לעומת תאים H9c2 לבטא ספוג פונקציונלי לטרוף. בנוסף, אנו מפתחים nanovector למסירה מערכתית של הבונה מיר-181-ספוג מאת complexing טעונה באופן חיובי liposomal חלקיקים של אניון פלסמידים מיר-181-ספוג. In vivo הדמיה של GFP מגלה כי מספר הזנב וריד זריקות של nanovector בתקופה של שלושה שבועות הם מסוגלים לקדם ביטוי משמעותי של מיר-181-הספוג באופן ספציפי סיבולת לב ריאה. חשוב, לאובדן של מיר-181 פונקציה הוא ציין את רקמת הלב אך לא הכליות או הכבד. MiRNA-הספוג היא שיטה חזקה כדי לעכב את הביטוי miRNA רקמות ספציפיות. נסיעה הביטוי miRNA-הספוג מקדם רקמות ספציפיות מספק ירידה לפרטים על עיכוב miRNA, אשר יכול להיות מבודד יישוב איברים או רקמות. יתר על כן, שילוב של טכנולוגיות nanovector ו- miRNA-הספוג מאפשר יעילה, רקמות ספציפיות miRNA עיכוב ויוו.
Introduction
בשני העשורים האחרונים, נעשו מחקרים רבים הצביעו על תפקיד משמעותי miRNAs בהתפתחות מחלות אנושיות. ממצאים מתוך גוף גדול של ספרות להדגים את חשיבותה להכחיש miRNAs בהתפתחות הפתופיזיולוגיה של מחלות, כמו סרטן1 ו-4,3,של מחלות לב וכלי דם2,5. לדוגמה, מיר-21 הוא upregulated ב סרטן רבים, וכתוצאה מכך מוגברת מחזור התא והתא התפשטות6. הפטיטיס C זיהומים, 122-מיר ממלא תפקיד חשוב ב השכפול של וירוס7, הוכח כי עיכוב של מיר-122 מקטין את העומס הנגיפי8. ב. היפרטרופיה, מיר-212/132 הוא upregulated בלב והוא מעורב פנוטיפ פתולוגיים9. החשיבות הברורה downregulation או עיכוב פונקציונלי של miRNA upregulated מציע הזדמנויות רפואית תוך ניצול הביולוגיה miRNA, כמעט כל המחלות.
בני המשפחה ארבעה מיר-181, מיר-181a/b/c/d, מצויים שלושה מיקומים גנומית הגנום האנושי. האזור intronic ללא קידוד RNA מארח גנים (MIR181A1-HG) מקודד האשכול של מיר-181-/ b-1. האזור intronic של הגן NR6A1 מקודד את מיר-181-/ b-2. האשכול מיר-181-c/d הינו ממוקם על תעתיק uncharacterized על כרומוזום 19. כל מיר-181 בני המשפחה לשתף אותו רצף “זרע”, כל בני המשפחה ארבע של מיר-181 פוטנציאלי יכול לווסת את המטרות mRNA זהה.
אנחנו3,4 ואחרים10 הדגישו את החשיבות של בני משפחתו מיר-181 במהלך לאי-ספיקה סופנית. אנחנו גם מזהה כי קולטנים upregulation מיר – 181c מתרחשת בתנאים פתולוגיים הקשורים לסיכון מוגבר למחלות לב, כגון סוג סוכרת II, השמנה, הזדקנות3,4,5. זה היה שמהווה ביטוי של מיר – 181c גורם סטרס חמצוני, מה שמוביל בתפקוד הלב4.
מספר קבוצות הראו כי miRNA קיים המיטוכונדריה11,12,13,14, אבל אנחנו היינו הראשונים להדגים את מיר – 181 c נגזר מן הגנום הגרעיני, עיבוד, ו לאחר מכן translocated המיטוכונדריה RISC3. יתר על כן, זיהינו ביטוי נמוך של מיר-181a ומיר-181b בתוך התא מיטוכונדריאלי של הלב5. חשוב, מצאנו את מיר – 181c represses הביטוי mRNA mt-COX1, ובכך הוכחת כי miRNAs להשתתף בוויסות גנטי מיטוכונדריאלי, לשנות את הפונקציה מיטוכונדריאלי3,4.
מאמר זה מתאר את המתודולוגיה נדרש לעצב miRNA-ספוג כדי להפיל את כל המשפחה מיר-181 ב cardiomyocytes. יתר על כן, אנו חלוקה לרמות פרוטוקול של יישום ויוו מיר-181-הספוג.
Protocol
Representative Results
Discussion
המאמר תיאר את העיצוב ואת סינתזה של miRNA-ספוג, הדגימו כיצד הביטוי רקמות ספציפיות של הספוג הוא כלי רב עוצמה כדי לעכב את הביטוי משפחה miRNA רקמות ספציפיות.
הראו משפחה מיר-181 מיקוד ספוג יכול להיות משובטים לתוך פלסמיד ביטוי עם מקדם ספציפיות הלב. פלסמיד שניתן לארוז ביעילות לתוך חלקיק na…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים אנתוני ק’ ל’ ליונג של המחלקה לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית, בלומברג בית הספר לבריאות הציבור, אוניברסיטת ג’ונס הופקינס טכנית שלו לעזור בעיצוב הבונה מיר-181-ספוג. אנו מודים גם פולינה Sysa-שאה, קתלין Gabrielson של המחלקה של מולקולרית ו Pathobiology השוואתית, מוסדות ג’ונס הופקינס לרפואה לסיוע טכני שלהם על ידי ההדמיה ויוו miRNA-הספוג דמי משלוח.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH, HL39752 (כדי צ’ארלס Steenbergen) על ידי מענק פיתוח מדען מן 14SDG18890049 American Heart Association (כדי Samarjit Das). האמרגן אירובי ספציפיים עכברוש סופק בנדיבות על ידי ג ‘ פרי Molkentin ד בבית החולים לילדים בסינסינטי.
Materials
| pEGFP-C1 vector | Addgene | 6084-1 | |
| In-fusion | Clontech | 121416 | |
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| miR-181-sponge synthesis | Introgen GeneArt | custome made | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | custome | |
| EcoRI enzymes | New Endland Biolabs | R0101S | |
| KpnI enzymes | New Endland Biolabs | R0142S | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Sigma-Aldrich | 11635379001 | |
| H9c2 cells | ATCC | CRL-1446 | |
| DMEM Media | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) | Lonza | VCA-1005 | |
| G418, Geneticin | Thermo Fisher Scientific | 11811023 | |
| FACSAria II Flow cytometer | BD Bioscience | 644832 | |
| Branson 450 sonifier | Marshall Scientific | EDP 100-214-239 | |
| The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device | Caliper Life Sciences | ||
| Anti-MTCO1 antibody | Abcam | ab14705 | |
| α-tubulin antibody | Abcam | ab7291 | |
| Sequoia C256 ultrasound system | Siemens |
References
- Hammond, S. M. microRNA detection comes of age. Nat Methods. 3 (1), 12-13 (2006).
- van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. The Journal of Clinical Investigation. 117 (9), 2369-2376 (2007).
- Das, S., et al. Nuclear miRNA regulates the mitochondrial genome in the heart. Circulation Research. 110 (12), 1596-1603 (2012).
- Das, S., et al. miR-181c regulates the mitochondrial genome, bioenergetics, and propensity for heart failure in vivo. PLoS One. 9 (5), e96820 (2014).
- Das, S., et al. Divergent effects of miR-181 family members on myocardial function through protective cytosolic and detrimental mitochondrial microRNA targets. Journal of the American Heart Association. 6 (3), e004694 (2017).
- Sicard, F., Gayral, M., Lulka, H., Buscail, L., Cordelier, P. Targeting miR-21 for the therapy of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 21 (5), 986-994 (2013).
- Jopling, C. L., Yi, M., Lancaster, A. M., Lemon, S. M., Sarnow, P. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific microRNA. Science. 309 (5740), 1577-1581 (2005).
- Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
- Ucar, A., et al. The miRNA-212/132 family regulates both cardiac hypertrophy and cardiomyocyte autophagy. Nature Communications. 3, 1078 (2012).
- Zhu, X., et al. Identification of micro-RNA networks in end-stage heart failure because of dilated cardiomyopathy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (9), 1173-1187 (2013).
- Bandiera, S., et al. Nuclear outsourcing of RNA interference components to human mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20746 (2011).
- Barrey, E., et al. Pre-microRNA and mature microRNA in human mitochondria. PLoS One. 6 (5), e20220 (2011).
- Bian, Z., et al. Identification of mouse liver mitochondria-associated miRNAs and their potential biological functions. Cell Research. 20 (9), 1076-1078 (2010).
- Kren, B. T., et al. MicroRNAs identified in highly purified liver-derived mitochondria may play a role in apoptosis. RNA Biology. 6 (1), 65-72 (2009).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Molkentin, J. D., Jobe, S. M., Markham, B. E. Alpha-myosin heavy chain gene regulation: delineation and characterization of the cardiac muscle-specific enhancer and muscle-specific promoter. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 28 (6), 1211-1225 (1996).
- Poliseno, L., et al. A coding-independent function of gene and pseudogene mRNAs regulates tumour biology. Nature. 465 (7301), 1033-1038 (2010).
- Henao-Mejia, J., et al. The microRNA miR-181 is a critical cellular metabolic rheostat essential for NKT cell ontogenesis and lymphocyte development and homeostasis. Immunity. 38 (5), 984-997 (2013).
- Williams, A., Henao-Mejia, J., Harman, C. C., Flavell, R. A. miR-181 and metabolic regulation in the immune system. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 78, 223-230 (2013).
- Hori, D., et al. miR-181b regulates vascular stiffness age dependently in part by regulating TGF-beta signaling. PLoS One. 12 (3), e0174108 (2017).
- Ebert, M. S., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: progress and possibilities. RNA. 16 (11), 2043-2050 (2010).
- Ma, L., et al. Therapeutic silencing of miR-10b inhibits metastasis in a mouse mammary tumor model. Nature Biotechnology. 28 (4), 341-347 (2010).
- Davis, S., Lollo, B., Freier, S., Esau, C. Improved targeting of miRNA with antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (8), 2294-2304 (2006).
- Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
- Elmen, J., et al. LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates. Nature. 452 (7189), 896-899 (2008).
- Esau, C. C. Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides. Methods. 44 (1), 55-60 (2008).
- Stenvang, J., Kauppinen, S. MicroRNAs as targets for antisense-based therapeutics. Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (1), 59-81 (2008).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. A direct comparison of anti-microRNA oligonucleotide potency. Pharmaceutical Research. 27 (9), 1788-1799 (2010).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. Chemical modification and design of anti-miRNA oligonucleotides. Gene Therapy. 18 (12), 1111-1120 (2011).
- van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles. Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (11), 860-872 (2012).
- Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
- Levin, A. A. A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides. Biochimica et Biophysica Acta. 1489 (1), 69-84 (1999).
- Flynt, A. S., Li, N., Thatcher, E. J., Solnica-Krezel, L., Patton, J. G. Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate. Nature Genetics. 39 (2), 259-263 (2007).
- Kloosterman, W. P., Lagendijk, A. K., Ketting, R. F., Moulton, J. D., Plasterk, R. H. Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development. PLoS Biology. 5 (8), e203 (2007).
- Martello, G., et al. MicroRNA control of Nodal signalling. Nature. 449 (7159), 183-188 (2007).
- Fabani, M. M., Gait, M. J. miR-122 targeting with LNA/2′-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates. RNA. 14 (2), 336-346 (2008).
- Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Research. 38 (13), 4466-4475 (2010).
- Babar, I. A., et al. Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), E1695-E1704 (2012).
- Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Research. 40 (5), 2152-2167 (2012).
- Kent, O. A., McCall, M. N., Cornish, T. C., Halushka, M. K. Lessons from miR-143/145: the importance of cell-type localization of miRNAs. Nucleic Acids Research. 42 (12), 7528-7538 (2014).
