Beta-celle funksjonen er viktig for blodsukker homeostase, som er evaluert encellede oppløsning bruker genetisk kodet reporter for kalsium tilstrømningen.
Bukspyttkjertelen beta-cellene svare på økende blod glukose konsentrasjoner av sekresjon hormon insulin. Dysfunksjon av beta-cellene fører til hyperglykemi og alvorlig, livstruende konsekvenser. Forstå hvordan beta-cellene opererer under fysiologiske forhold og hvilke genetiske og miljømessige faktorer kan føre deres dysfunksjon kan føre til bedre behandlingstilbud for diabetiker pasienter. Muligheten til å måle kalsium nivåer i beta-cellene fungerer som en viktig indikator for beta-celle funksjonen, som tilstrømningen av kalsium ioner utløsere insulin utgivelsen. Her beskriver vi en protokoll for overvåking glukose-stimulert kalsium tilstrømningen i sebrafisk beta-cellene ved hjelp av GCaMP6s, en genetisk kodet sensoren av kalsium. Metoden kan overvåke intracellulær kalsium dynamikken med encellede oppløsning i ex vivo montert holmer. Glukose-responsen til beta-cellene i den samme Holmen kan hentes samtidig under forskjellige glukose konsentrasjoner som antyder tilstedeværelsen av funksjonelle heterogenitet blant sebrafisk beta-cellene. Videre er gir teknikken høy timelige og romlig oppløsning, som avslører oscillasjon natur kalsium tilstrømningen på glukose stimulering. Vår tilnærming åpner dørene for å bruke sebrafisk som modell for å undersøke bidrag av genetiske og miljømessige faktorer beta-celle funksjonen og dysfunksjon.
Våre blodsukker opprettholdes i et lite område, i stor grad på grunn av funksjon av endokrine bukspyttkjertelen. Endokrine rollen bukspyttkjertelen utføres av holmer Langerhans, som inneholder hormon-sekresjon celler. Insulin sekresjon beta-cellene er ansvarlige for å redusere nivået av blodsukker etter et karbohydrat inneholder måltid. Utilstrekkelig insulinsekresjon fra beta-celle kan føre til diabetes1, som er preget av vedvarende høyt blodsukker. Type 1 og Type 2 Diabetes, som nå rammer mer enn 400 millioner mennesker over hele verden, fører til sykelighet og dødelighet2. Ved å undersøke de molekylære og miljømessige faktorene som bidrar til beta-celle dysfunksjon, vil vi forstå bedre hvordan type 2 diabetes starter og utvikler seg. I tillegg kan muligheten til å skille menneskelige stamceller i funksjonelle beta-cellene i vitro gi en kilde til nye beta-cellene for celle-erstatning terapi i Type 1 Diabetes. Dette er det viktig å studere beta-celle funksjonen og modning i genetisk modell organismer for å få den nødvendige kunnskapen for å gjøre funksjonelle beta-cellene i en rett.
Beta-celle funksjonen kan overvåkes på hele-Holme nivå av kvantifisere den totale mengden insulin utskilles i respons på glukose-stimulering. Denne kumulative studier Holmen som en enkelt gruppe celler uten skille en celle personlige egenskaper. Men avslørte analyse av glukose svar på beta-enkeltceller et mangfold i beta-cellene funksjonelle egenskaper og tilstedeværelsen av heterogenitet3. For å vurdere funksjon av beta-enkeltceller, er det mulig å overvåke intracellulær endringene føre til insulin sekresjon4. Insulinsekresjon er foran en oppføring av glukose i beta-cellene. Glukose som angir i beta-cellene metaboliseres raskt til ATP. Høyere intracellulær ATP konsentrasjoner reduserer åpne sannsynligheten for ATP-sensitive kalium ionekanaler fører til beta-celle depolarization. Depolarization åpner spenning-sensitive kalsium ion kanalene og øker intracellulær kalsium. I sin tur utløser kalsium exocytosis av insulin, som er utgitt i sirkulasjon og senker blodsukkeret ved å fremme glukose-utnyttelse5,6,7.
Flere strategier er brukt for å undersøke funksjonen av beta-cellene, inkludert overvåking av membran potensialet8, direkte visualisering av insulin-blemmer exocytosis9og kvantifisering av intracellulær Ca2 + strøm som en proxy for glukose-respons10. Blant dem gir bildebehandling av intracellulær Ca2 + fordelen av opp-skalering analyse på flere individuelle celler i den samme Holme11,12, tillater for direkte sammenligning av glukose-responsen mellom enkelte beta-cellene. Intracellulær Ca2 + konsentrasjon kan overvåkes ved hjelp av kalsium-sensitive fluorescerende fargestoffer13 eller genetisk kodet kalsium indikatorer (GECIs)14. Mens kalsium-indikator fargestoffer mangel celle-type spesifisitet, GECIs kan uttrykkes i en bestemt celle type av bestemte arrangørene. Dessuten gir den nye generasjonen av GECIs, som GCaMP6, bedre signal-til-støy-forhold med raskere timelige dynamics15. Her beskrive vi nytten av den nye generasjonen av GECIs, i bestemte GCaMP6s, visualisere kalsium i beta-celler i én celle oppløsning. Vi bruke denne metoden sebrafisk primære Holmen som vår modell av valg. Under embryonale utviklingen, beta-cellene i den primære Holmen kommer fra den rygg og ventrale bukspyttkjertelen knopper16. Den primære Holmen ligger en stereotype anatomisk posisjon innenfor sebrafisk bukspyttkjertelen, slik at dens enkel identifisering og isolering. Beta-cellene i den primære Holmen er nødvendig for glukose-regulering, som deres genetisk ablasjon fører til hyperglykemi17,18. Videre svarer disse beta-cellene glukose under tidlig sebrafisk utvikling19. Denne protokollen kan også brukes i imaging sekundære øyene, som er under den etter embryonale stadier. Protokollen lar bildet beta-cellene ex vivo, ved senere stadier av utvikling og under definerte glukose konsentrasjoner.
Her viser vi en teknikk for kvantifisering av beta-celle glukose respons på encellede oppløsning. Dette er gjort mulig ved å overvåke intracellulær kalsium konsentrasjon med en genetisk kodet kalsium indikator, GCaMP6s. Beta-celle aktiviteten er fanget ex vivo montering Holme i en fibrinogen-trombin mold. En kritisk trinn av protokollen er stabilitet av mold. Tilstrekkelig tid må gis for fibrinogen å oppløse i HBSS løsningen. Uten dette, mold ikke danner tilstrekkelig for å gi stabilitet under imaging-økten. En Holme montert i fibrinogen-trombin mold og midt i celle kultur medier kan være levedyktig i minst en uke (data ikke vist). Alternativer til fibrinogen-trombin mold, som lav-smelte agarose, kan benyttes for å montere det Holme22. En annen viktig parameter er Disseksjon av øyen. I dette trinnet må i vevet rundt Holmen fjernes uten skade eller poking Holmen. En dyktig disseksjon kommer med praksis.
En begrensning av tenkelig protokollen er begrensning til en AC confocal plan Holmen. Dette gjøres for å fange dynamikken i kalsium tilstrømningen i beta-enkeltceller. En Z-stabel gjennom hele tykkelsen på Holmen fører til lav tenkelig hastigheter og tap av oscillasjon signal fra enkeltceller. Denne begrensningen kan forbedres ved hjelp av raskere hjelp av AC confocal-imaging som spinner disken mikroskopi, aktivere fange kalsium dynamikken i 3-dimensjoner. En grense ville være i vivo kalsium tenkelig12. Gjennomsiktig natur sebrafisk embryo eller bruk av pigment-mindre stammer av sebrafisk voksne23 kunne åpne muligheten for i vivo imaging i fremtiden.
Avbilding av beta-celle aktivitet på romlige og tidsmessige høyoppløselig kan undersøke den funksjonelle heterogeniteten blant enkelte beta-cellene. Denne tilnærmingen kan bidra til å belyse eksistensen av beta-celle undergrupper. Nylig har flere studier vist eksistensen av subpopulasjoner nominelt homogen beta-cellene24,25,26. Ex vivo bildebehandling kan kombineres med genetisk journalister å karakterisere sub-befolkningen respons til glukose. I tillegg kan kombinerer tenkelig oppsettet med farmakologiske stimulering gi screening av stoffer som kan forbedre beta-celle funksjonen.
Oppsummert kan teknikken presenteres her kvantifisering og sammenligning av glukose responsen for beta-enkeltceller. Det gir et direkte vindu i beta-celle funksjonen, en viktig parameter i utviklingen av diabetes.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmer av Ninov laboratorium for kommentarer på manuskriptet, medlemmer av Center for regenerativ terapier Dresden (CRTD) fisk og mikroskopi anlegg for teknisk assistanse. N.N. støttes av finansiering fra DFG-CRTD, Cluster of Excellence ved TU Dresden, tysk Research Foundation (DFG) og tysk Center for Diabetes forskning (DZD).
Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) | By request from authors | ||
Stereo microscope | ZEISS | 495015-0001-000 | SteREO Discovery.V8 |
Fluorescence lamp | ZEISS | 423013-9010-000 | Illuminator HXP 120 V |
Red Filter Cube | ZEISS | 000000-1114-462 | Filter set 45 HQ TexasRed |
Confocal Microscope | ZEISS | LSM 780 | |
Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
HBSS (Hanks' Balanced Salt solution) | ThermoFisher | 14025092 | |
Thrombin | Sigma | T4648 | |
D-Glucose | Sigma | G8270 | |
KCl | Sigma | P9333 | |
35 mm diameter glass-bottom dishes | ThermoFisher | 150680 | |
tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Fine Forceps | Fine Science Tools | 11445-12 | |
FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e | https://fiji.sc/ | ||
R, version 3.2.4 | https://www.r-project.org/ | ||
RStudio | https://www.rstudio.com/ | ||
plotcelltrace.R | A custom script provided with the manuscript |