In Situ Hybridisering teknikker for parafin-Embedded voksen Coral prøver
Summary
Målet med denne protokollen er å utføre i situ hybridisering på voksen coral prøver som er innebygd i parafin og delt på glass lysbilder. Dette er en kvalitativ metode som brukes til å visualisere romlige uttrykk for en RNA anti-følelse sonde i parafin-embedded vev.
Abstract
Korallene er viktig hav dyr som er kritiske for havet helse samt helse. Men på grunn av menneskelig virkninger som stigende hav temperaturer og ocean forsuring er koraller stadig under trussel. For å håndtere disse utfordringene, fremskritt i cellen og molekylærbiologi har vist seg for å være avgjørende for å diagnostisere helse koraller. Endre noen av teknikkene som vanligvis brukes i human medisin kan forbedre forskernes evne til å behandle og lagre koraller. For å løse dette, er en protokoll for i situ hybridisering brukt hovedsakelig i human medisin og evolusjonær utviklingsbiologi tilpasset for bruk i voksen koraller under stress.
Formålet med denne metoden er å visualisere romlige uttrykk for en RNA sonde i voksen coral vev som er innebygd i parafin og delt på glass lysbilder. Denne metoden fokuserer på fjerning av parafin og utvanning av utvalget, forbehandling av utvalget slik permeabilitet av prøven, før hybridisering inkubering, blanding av RNA sonden og visualisering av RNA sonden. Dette er en kraftig metode ved ikke-modellen organismer for å oppdage hvor bestemte gener som er uttrykt, og protokollen kan lett tilpasses for andre ikke-modellen organismer. Men er metoden begrenset i at det er primært kvalitative, fordi uttrykket intensitet kan variere avhengig av hvor mye tid brukt under visualisering trinnet og konsentrasjonen av sonden. Videre er tålmodighet nødvendig, som denne protokollen kan ta opptil 5 dager (og i mange tilfeller lengre) avhengig av proben som brukes. Til slutt, ikke-spesifikke bakgrunnen flekker er vanlig, men denne begrensningen kan overvinnes.
Introduction
Koraller er kritisk økosystem byggherrer og viktig for biologisk mangfold i havet og helse1,2,3. De er truet klimaendringer og andre menneskeskapte stressfaktorer, og mange korallrev er betraktet som kritisk truet. Dermed er det et betydelig behov for mobilnettet og molekylære verktøy å diagnostisere koraller under stress. Også er det lite forstått om hvor gener som er uttrykt i voksen coral vev og derfor liten forståelse av funksjonene til disse genene. For å løse dette problemet, har vi tilpasset i situ hybridisering (ISH) protokollen, vanligvis brukes i human medisin og evolusjonær utviklingsbiologi, for bruk på parafin-embedded vevsprøver av voksen koraller. Denne teknikken er mest effektive når de brukes på voksen koraller som har gjennomgått en trykk begivenhet som utsettes for varmestress. Men denne teknikken kan brukes på en rekke vev og stadier i koraller og er ikke begrenset til bare varme-stresset koraller4,6,7. I tillegg, kan denne teknikken brukes på vev eller celler av noen metazoan så lenge det finnes cDNA oppstartsrekkefølgen.
Formålet med denne metoden er å visualisere RNA sonder i voksen coral vev som har blitt bevart og innebygd i parafin og delt på lysbilder. Denne metoden er en kraftig diagnoseverktøy som gir visualisering av nukleinsyrer i voksen coral vev. Utgangspunktet denne metoden ble utviklet for medisinsk diagnostikk, og det har siden blitt et populært verktøy i områder som utviklingsbiologi og evolusjonær utviklingsbiologi8,9,10. ISH er også en viktig metode, spesielt i ikke-modellen systemer, når genomisk og transcriptomic sekvens data finnes men romlige gene expression mønstre er ukjent. Diagnostiske arbeid i ikke-modellen systemer er denne teknikken kraftig fordi indikere hvilke celler og vev express en genet av interesse og kan føre til mer målrettet terapeutiske metoder8,9,10, 11,12. Endelig er denne teknikken kvalitativ og kraftigere når sammenkoblet med kvantitativ gene expression data11.
Framgangsmåte som er skissert i denne utredningen vil være av interesse for forskere som har allerede utformet en digoxigenin (graver)-merket RNA sonde (både fornuftig og antisense sonder) og er nå klar til å utføre i situ blanding av sonder et utvalg. For å utføre denne metoden, trengs to serielle deler av en parafin coral vev for hver probe testes. En del vil bli brukt for følelse sonden og den andre for antisense sonden. Følelse sonden vil være en kontroll for å angi ikke-spesifikk bindende. Hvis flekker er observert i følelse sonden, så er antisense sonden ikke spesifikke for RNA rundt. Sonder kan være konstruert for noen genet uttrykt. I denne protokollen, flere eksempler brukes som fantes tidligere til uttrykk under varmestress i koraller: FBJ murint osteosarcoma viral oncogene homolog B (Fos-B), aktivator protein (AP1), og Tumor nekrose faktor reseptor 41 (TNFR 41)11. ISH bruker grave-merket RNA sonder er foretrukket over bruker radioaktivt sonder fordi deres er mye tryggere10. Dessuten, denne teknikken er svært følsom og kan utføres på et bredt spekter av vev og embryo utover varme-stresset voksen koraller13,14,15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden beskrevet i denne protokollen er endret fra tidligere arbeid i medisinske og evolusjonære utviklingsmessige forskning8,9,10,12,17. Denne protokollen fokuserer på nyansene av en i situ hybridisering med en grave-merket RNA anti-følelse sonde på voksen koraller, som har blitt bevart og innebygd i parafin. Denne metoden kan enkelt overføres …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av prisen ikke. OCÉ-1323652 gjennom de National Science Foundation Ocean Science Postdoctoral Fellowship og award no.1012629 fra Burroughs Wellcome fondet postdoktor berikelse programmet.
Materials
| Denhardt's solution | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| Slide mailers | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Alkaline phosphatase buffer | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Falcon tubes | Fisher | 14-959-49A | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| UltraPure Salmon Sperm DNA solution | Invitrogen | 15632-011 | |
| Slide white apex superior adhesive | Leica Biosystems | 3800080 | |
| PBS solution, pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Liquid Blocker | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Formaldehyde solution, 500 mL size | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentration | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xylenes, AR (ACS), For Histological Use | VWR | MK866806 | |
| Ethanol | VWR | EM-EX0276-4S | |
| TE buffer | VWR | PAV6232 | |
| hybridization oven | VWR | 97005-252, 97005-254 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 |
References
- Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933 (2003).
- Chen, P. -. Y., Chen, C. -. C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318 (5857), 1742 (2007).
- Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).
- Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria – ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).
- Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).
- Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).
- Darby, I. A., Hewitson, T. D. . In situ hybridization protocols. , (2006).
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. . In situ hybridization. , (1987).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).
- Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900 (2013).
- Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).
- Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6 (1), (2015).
- Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).
- Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).
- Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).
