Detta protokoll visar hur du ställer in en pålitlig HFS metod hos möss. Nervceller i hippocampus dentate gyrus stimuleras elektriskt av HFS direkt och indirekt i vivo. Neuronal aktivitet och molekylär signalering granskas av c-fos och Notch1 Immunofluorescerande färgning, respektive; neurogenes kvantifieras i Bromdeoxiuridin märkning assay.
Elektrisk högfrekvent stimulering (HFS), med inopererade elektroder inriktning olika hjärnregioner, har bevisats som en effektiv behandling för olika neurologiska och psykiatriska sjukdomar. HFS i regionen djupt i hjärnan, också heter deep-hjärnstimulering (DBS), blir allt viktigare i kliniska prövningar. Senaste framsteg i hög frekvens DBS (HF-DBS) kirurgi har börjat sprida sig möjligheten att utnyttja denna invasiv teknik till andra situationer, till exempel behandling av egentlig depression disorder (MDD), tvångssyndrom (OCD), och så på.
Trots dessa expanderande indikationer förblir de bakomliggande mekanismerna för de positiva effekterna av HF-DBS gåtfulla. För att lösa denna fråga, är en metod att använda implanterade elektroder som glest aktiverar distribuerade subpopulations av nervceller av HFS. Det har rapporterats att HFS i främre kärnan i thalamus kan användas för behandling av refraktär epilepsi i kliniken. De bakomliggande mekanismerna kan vara relaterat till de ökade neurogenes och förändrad neuronal aktivitet. Därför är vi intresserade av att utforska de fysiologiska förändringarna av detektion av neuronal aktivitet samt neurogenes i mus dentate gyrus (GD) före och efter HFS behandling.
I detta manuskript beskriver vi metoder för HFS att rikta aktivering av GD i möss, direkt eller indirekt och på ett sätt som akut eller kronisk. Dessutom beskriver vi ett detaljerat protokoll för beredning av hjärnan skivor för c-fos och Notch1 Immunofluorescerande färgning för att övervaka neuronala aktiviteten och signalering aktivering och Bromdeoxiuridin (BrdU) märkning för att avgöra den neurogenes efter HF-DBS induktion. Aktiveringen av neuronal aktivitet och neurogenes efter HF-DBS behandling ger direkta neurobiologiska bevis och potentiella terapeutiska fördelar. Särskilt kan denna metod vara och tillämpas för att rikta andra intresserade hjärnan såsom de basala ganglierna och subthalamic regioner för specifika hjärnsjukdomar i kliniken.
HF-DBS är en Neurokirurgiska teknik för elektrisk stimulering i hjärnan, som har utvecklats sedan 1870-talet1. I slutet av 1980, HFS användes först som en potentiell terapeutisk intervention för Parkinsons sjukdom och annan rörelse besvär2. I de senaste decennierna, har HF-DBS mer och mer allmänt använts i behandling av sjukdomar i hjärnan som är för närvarande icke behandlingsbar av en traditionell terapeutisk strategi. Särskilt på grund av exakthet förbättring av HFS elektroden, mycket effektiva resultat och minimala biverkningar, antalet sjukdomar i hjärnan behandlas av HF-DBS ökat betydligt under senaste decennierna3,4, 5. Till exempel har HF-DBS godkänts av den amerikanska Food and Drug Administration (FDA) för behandling av Parkinsons sjukdom (PD), Alzheimerdemens typ, essentiell tremor och andra typer av rörlighet störningar2,6, 7. PD patienter, dopaminerga medicineringen minskas upp till 50% under HF-DBS8. Förutom en framgångsrik behandling av rörelsestörningar, har HF-DBS också visat sin kraftfulla effekter vid behandling av psykiatriska sjukdomar i kliniken, och för kognitiv bröstförstoring som väl2,9, 10 , 11. det bör noteras att forskningen av HFS för behandling av andra psykiatriska störningar är i olika stadier, erbjuder mycket löfte till patienter12.
Även om många studier har visat att en fokal HFS har både lokala och fjärranslutna effekter i hela hjärnan13, fortfarande de neurologiska och molekylära mekanismerna av effekterna gäckande2,14. I kliniken, är terapeutiska HF-DBS vanligen tillämpas på ett långsiktigt sätt för behandling av Parkinsons sjukdom och kronisk smärta, etc. många åsikter höjs för att förklara den förbättring som genereras av en HF-DBS-behandling, bland vilka en möjlighet att HFS nuvarande modulerar den neuronala nätverksaktiviteten, förmodligen av en repetitiv depolarisation av axoner i närheten av den implanterade HFS-elektroden. Eller HF-DBS kan ändra ansvarsfrihet för utdata nervceller och de planerade målen. Också, HF-DBS kan leda till långsiktiga synaptic förändringar, inklusive långsiktig potentiering (LTP) och långvarig depression (LTD), vilket kan bidra till en symtomatisk förbättring. Hittills, det är fortfarande oklart huruvida HFS påverkan de viktiga molekylära händelser som reglerar cellulär bearbetar sådana som adult neurogenes i vivo. Flera rader av studier har visat att HFS hos gnagare kunde härma liknande neurala Svaren kliniskt tillämpad DBS15,16. För att förstå de bakomliggande cellulära mekanismerna för HF-DBS, i denna studie ställa vi först in en i vivo HFS metodik hos möss i en akut (en dag) eller kronisk (fem dagar) sätt. För det andra, vi satte upp en aktivering analys-metod att bestämma ändringen av neuronal aktivitet och neurogenes efter en HF-DBS-leverans.
Eftersom produktionen av neuronala från neurala stamceller är rikligt under den embryonala utvecklingen men fortsätter under hela vuxenlivet, Hippocampus subgranulära zonen är ett av de stora områden där neurogenes uppstår. Processen att neurogenes är influerad av många fysiologiska och patologiska faktorer. I vissa epileptiska fall är i hippocampus neurogenes dramatiskt minskad17,18. Dessutom kunde en enda elektrokonvulsiv terapi avsevärt öka neuronal produktionen i dentate gyrus19. Dessa observationer tyder på att den elektrofysiologiska aktiviteten spelar en avgörande roll i regleringen av adult neurogenes och synaptisk plasticitet i hippocampus nervceller. Därför, för att ytterligare påvisa effekterna av HF-DBS på neuronal aktivitet och neurogenes, vi först genomföra en immunfärgning haltbestämning av den omedelbara tidiga-genen (IEG)- c-fos som är en välkänd markör för kortsiktiga neuronal aktivitet som följd av Upplev20. Notch1 signalering upptäcks också för att övervaka signalering aktiveringen efter HFS leverans21,22. Dessutom upptäcka vi också neuronala produktionen av en BrdU märkning analys efter HF-DBS induktion på olika sätt, även om BrdU färgning kan också vara en markör för gliogenesis.
I den aktuella studien är två HFS metoder anpassade att rikta aktivering av hippocampus GD direkt och indirekt. Elektroden är implanteras i GD direkt eller implanteras i den mediala perforant sökvägen (PP) som sänder prognoser till aktivera GD nervceller. För HF-DBS induktion presenteras en programmerbar stimulator för en kontinuerlig stimulering via fast elektroden på mus huvudet. För att avgöra effekterna av HFS på neuronal aktivering och neurogenes, vi upptäcker uttryck för c-fos och Notch1 av Immunofluorescerande färgning och antalet BrdU-ingår positiva neuroner i regionen Hippocampus GD, respektive, efter HFS behandling. Särskilt, jämförs HF-DBS effekter på neurogenes i GD mellan en akut och en kronisk stimulering sätt, eller mellan en direkt och en indirekt stimulans sätt, respektive.
HF-DBS tekniken har använts som ett kraftfullt verktyg för behandling av många neurologiska sjukdomar sedan 1990-talet. Hittills, är landmark arbete HF-DBS för behandling av Parkinsons sjukdom och essentiell tremor, som har rönt mycket uppmärksamhet och intresse både på klinik och forskarsamhället. Det finns olika typer av pågående HF-DBS studier av många grupper för HF-DBSS terapeutisk tillämpning i vissa neurologiska och psykiatriska störningar32,33</…
The authors have nothing to disclose.
Stöds av National Natural Science Foundation av Kina bidrag 31522029, 31770929 och 31371149 (till Haitao Wu), programmera 973 (2014CB542203) från det statliga Key Development programmet för grundforskning av Kina (till Haitao Wu) och Grant Z161100000216154 från den Beijing Municipal vetenskap och teknik kommissionen (till Haitao Wu). Författarna vill tacka alla medlemmar för Haitao Wu laboratoriet för deras uppmuntran och diskussioner. Författarna är ytterst tacksamma för Zhenwei Liu för hans hjälp med felsökning av apparaten.
Brain stereotaxic instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic intracranial implantation for mouse |
Stimulator | A-M systems | Model 3800 | MultiStim 8-Channel programmable stimulator |
Dental driller | Saeshin Precision Co., Ltd | STRONG 90 | For drilling and crainiotomy |
Burr | Meisinger | HM1 005# | For drilling and crainiotomy |
Digidata 1550 Digitizer | Molecular Devices | AXON 1550 | High-resolution data acquisition |
Cryotome | Thermo Fisher Scientific | Thermo Cryotome FSE | Cutting frozen sections of specimens |
Confocal microscope | Olympus | FV-1200 | Japan, with 20x Objective (NA 0.45) |
Mouse surgery tools | F.S.T. | 14084-08,11254-20,16109-14 | Scissors, forceps, bone cutter, holders etc. |
Pentobarbital sodium | R&D systems | 4579 | 20-50mg/kg for i.p. injection |
Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032 | 75,000 U for i.m. injection |
Carprofen | Sigma-Aldrich | SML1713 | 5-10mg/kg, for s.c. injection |
4% Paraformaldehyde (PFA) | Beijing Solarbio Sci-Tech Co. | P1110 | stocking solution for tissue fixation |
Phosphate buffer (PBS) | Invitrogen | 10010023 | pH7.4, 500ml in stocking |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | Formulation of water-soluble glycols and resins |
anti-BrdU antibody | Abcam | ab6326 | Dilutions:1/800 |
anti-c-fos antibody | Abcam | ab209794 | Dilutions:1/500 |
Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568) | Thermo Fisher Scientific | A11036 | Dilutions:1/500 |
Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488) | Jackson ImmunoResearch | 712-546-150 | Dilutions:1/500 |
Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Counterstaining with DAPI |
anti-Notch1 antibody (C-20) | Santa Cruz Biotech | sc-6014 | Dilutions:1/50 |
Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | Dilutions:1/1000 |