En invasiv metode for aktivering af musen Dentate Gyrus af højfrekvente Stimulation

Summary

Denne protokol viser, hvordan du konfigurerer en pålidelig HFS metode i mus. Neuroner i hele den hippocampus dentate gyrus stimuleres elektrisk af HFS direkte og indirekte in vivo. Neuronal aktivitet og molekylær signalering er undersøgt af c-fos og Notch1 immunfluorescent farvning, henholdsvis; neurogenese er kvantificeret ved bromodeoxyuridine mærkning assay.

Abstract

Elektrisk højfrekvente stimulation (HFS), ved hjælp af implanterede elektroder rettet mod forskellige områder af hjernen, er blevet bevist som en effektiv behandling for forskellige neurologiske og psykiatriske lidelser. HFS i den dybe region af hjernen, også kaldet dyb brain stimulation (DBS), bliver stadig vigtigere i kliniske forsøg. De seneste fremskridt inden for høj-frekvens DBS (HF-DBS) kirurgi er begyndt at sprede mulighed for at udnytte denne invasive teknik til andre situationer, som behandling for svær depression lidelse (MDD), obsessiv-kompulsiv sygdom (OCD), og så på.

Trods disse ekspanderende indikationer stadig de underliggende mekanismer af de gavnlige virkninger af HF-DBS gådefulde. For at løse dette spørgsmål, er en metode at bruge implanterede elektroder, der sparsomt aktiverer distribuerede delpopulationer af neuroner af HFS. Det er blevet rapporteret, at HFS i forreste kernen i thalamus kunne bruges til behandling af refraktær epilepsi i klinikken. De underliggende mekanismer kan være relateret til den øgede neurogenese og ændret neuronal aktivitet. Vi er derfor interesserede i at udforske de fysiologiske ændringer ved påvisning af neuronal aktivitet samt neurogenese i mus dentate gyrus (GD) før og efter HFS behandling.

I dette manuskript beskriver vi metoder til HFS at målrette aktivering af GD i mus, direkte eller indirekte og på en måde, akut eller kronisk. Derudover beskriver vi en detaljeret protokol for forberedelse af hjernen skiver for c-fos og Notch1 immunfluorescent farvning for at overvåge den neuronal aktivitet og signalering aktivering og bromodeoxyuridine (BrdU) mærkning for at bestemme den neurogenese efter HF-DBS induktion. Aktivering af neuronal aktivitet og neurogenese efter HF-DBS behandling giver direkte neurobiologiske beviser og potentielle terapeutiske fordele. Denne metode kan især, ændres og anvendes for at målrette andre interesserede hjernen såsom de basale ganglier og subthalamic regioner for specifikke hjernen lidelser i klinikken.

Introduction

HF-DBS er en neurokirurgiske teknologi til elektrisk stimulation i hjernen, som er blevet udviklet siden 1870s¹. I slutningen af 1980 ‘ erne, HFS blev først brugt som en potentiel terapeutisk intervention for Parkinsons sygdom og andre bevægelse lidelser². I de sidste par årtier, har HF-DBS været mere udbredt i behandlingen af hjernen lidelser, der er i øjeblikket uhelbredelige af en traditionel terapeutisk strategi. Især på grund af en nøjagtighed forbedring af HFS elektrode, yderst effektive resultater og minimale bivirkninger, antallet af hjernen lidelser behandles af HF-DBS steget betydeligt i seneste årtier^{3,4, 5}. For eksempel, er HF-DBS blevet godkendt af US Food and Drug Administration (FDA) til behandling af Parkinsons sygdom (PD), Alzheimers type demens, væsentlige tremor og andre typer af bevægelse lidelser^{2,6, 7}. i PD patienter, Dopaminerg medicin er reduceret op til 50% i løbet af HF-DBS⁸. Ud over den vellykkede behandling af bevægelsesforstyrrelser, har HF-DBS også vist sin kraftfulde effekter i behandlingen af psykiatriske sygdomme i klinikken, og for kognitive augmentation som godt^{2,9, 10 , 11}. det skal bemærkes, at forskning af HFS til behandling af andre psykiatriske lidelser er i forskellige stadier, tilbyder meget løfte om at patienter¹².

Selv om mange undersøgelser har vist, at en fokal HFS har både lokale og eksterne virkninger i hele hjernen¹³, stadig de neurologiske og molekylære mekanismer af virkningerne undvigende^2,14. I klinikken anvendes terapeutiske HF-DBS normalt på en langsigtet måde til behandling af Parkinsons sygdom og kroniske smerter, etc. mange udtalelser er rejst for at forklare forbedring genereret af en HF-DBS behandling, blandt hvilke en mulighed at HFS aktuelt modulerer neuronal netværksaktivitet, sandsynligvis af en gentagne depolarisering af axoner i nærheden af den implanterede HFS elektrode. Eller HF-DBS kan ændre decharge rate af output-neuroner og de planlagte mål. Også HF-DBS kan føre til langsigtede synaptic ændringer, herunder langsigtede potensering (LTP) og langvarig depression (LTD), som kan bidrage til en symptomatisk forbedring. Så langt, det er stadig uklart om HFS influences de molekylære nøglebegivenheder, der regulere cellulære processer såsom som voksen neurogenese in vivo. Flere linjer af undersøgelser har vist, at HFS i gnavere kunne efterligne lignende neurale svar af klinisk anvendt DBS^15,16. For at forstå de underliggende cellulære mekanismer af HF-DBS, i denne undersøgelse, definere vi først en i vivo HFS metode i mus i en akut (én dag) eller kronisk (fem dage) måde. For det andet, vi oprette en analyse metode til at bestemme ændringen af neuronal aktivitet og neurogenese efter en HF-DBS levering.

Neuronal produktion fra neurale stamceller er rigelige i den embryonale udvikling men fortsætter gennem hele voksenlivet, er at hippocampus subgranular zone en af de vigtigste områder, hvor neurogenese opstår. Processen med neurogenese påvirkes af mange fysiologiske og patologiske faktorer. I visse epileptiske tilfælde er den hippocampus neurogenese drastisk nedsat^17,18. Derudover kunne et enkelt elektrochok behandling betydeligt øge neuronal produktionen i dentate gyrus¹⁹. Disse observationer tyder på at den elektrofysiologiske aktivitet spiller en afgørende rolle i reguleringen af voksen neurogenese og synaptisk plasticitet i hippocampus neuroner. Derfor, at yderligere demonstrere virkningerne af HF-DBS neuronal aktivitet og neurogenese, vi først gennemføre en immunfarvning analyse af den umiddelbare tidlig gen (IEG) c-fos som er en velkendt markør af kortsigtede neuronal aktivitet som følge af opleve²⁰. Notch1 signalering er også opdaget for at overvåge signaling aktivering efter HFS levering^21,22. Desuden, vi opdager også neuronal produktion af en BrdU mærkning analyse efter HF-DBS induktion i forskellige manerer, selvom BrdU farvning kan også være en markør for gliogenesis.

I den foreliggende undersøgelse er to HFS metoder tilpasset til at målrette aktivisering hippocampus GD direkte og indirekte. Elektroden er implanteret i GD direkte eller implanteres i mediale perforant sti (PP), som sender projektioner til at aktivere GD neuroner. For HF-DBS induktion præsenteres en programmerbar stimulator for en kontinuerlig stimulering via den faste elektrode på musen hoved. For at fastslå virkningerne af HFS på neuronal aktivering og neurogenese, vi opdager udtryk af c-fos og Notch1 af immunfluorescent farvning og antallet af BrdU-indarbejdet positive neuroner i regionen hippocampus GD for henholdsvis efter HFS behandling. Især, sammenlignes virkningerne af HF-DBS på neurogenese i Generaldirektoratet for mellem en akut og en kronisk stimulering måde, eller mellem en direkte og en indirekte stimulering måde, henholdsvis.

Protocol

Animalske procedurer eksperimentelle institutionelle retningslinjerne i Beijing Institute of grundlæggende Medical Sciences (Beijing, Kina) og de kinesiske statslige forskrifter for pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Mus (voksne mandlige, 26 ~ 30 g) blev opstaldet og holdes ved en konstant temperatur på 23 ° C, med vand og mad ad libitum, under en 12-h lys/12-h mørke cyklus (lys på klokken 7:00). Alle eksperimentelle procedurer blev udført i løbet af lys cyklus. 1. kirurgisk for…

Representative Results

Efter HF-DBS stimulation til hippocampus GD underregionen direkte eller PP underregionen at aktivere GD indirekte via indsat elektroder ved hjælp af de stereotactic justeringer, gnavere var anesthetized med pentobarbital og stikprøven 3 h efter den sidste HF-DBS stimulation for c-fos og Notch1 immunfarvning. For BrdU farvning, 36 timer efter den sidste BrdU injektion efter 1 dags eller 5 dage af HF-DBS stimulation, var gnavere anesthetized med pentobarbital til forbere…

Discussion

HF-DBS teknik har været meget anvendt som et kraftfuldt værktøj til behandling af mange neurologiske lidelser siden 1990s. Hidtil er den skelsættende arbejde af HF-DBS til behandling af Parkinsons sygdom og væsentlige tremor, som har tiltrukket sig megen opmærksomhed og interesse både i klinikken og videnskabelige samfund. Der er forskellige typer af igangværende HF-DBS undersøgelser af mange grupper for HF-DBS terapeutisk anvendelse i visse neurologiske og psykiatriske lidelser^32,</…

Materials

Brain stereotaxic instrument	Stoelting	51730D	Stereotactic intracranial implantation for mouse
Stimulator	A-M systems	Model 3800	MultiStim 8-Channel programmable stimulator
Dental driller	Saeshin Precision Co., Ltd	STRONG 90	For drilling and crainiotomy
Burr	Meisinger	HM1 005#	For drilling and crainiotomy
Digidata 1550 Digitizer	Molecular Devices	AXON 1550	High-resolution data acquisition
Cryotome	Thermo Fisher Scientific	Thermo Cryotome FSE	Cutting frozen sections of specimens
Confocal microscope	Olympus	FV-1200	Japan, with 20x Objective (NA 0.45)
Mouse surgery tools	F.S.T.	14084-08,11254-20,16109-14	Scissors, forceps, bone cutter, holders etc.
Pentobarbital sodium	R&D systems	4579	20-50mg/kg for i.p. injection
Penicillin G	Sigma-Aldrich	P3032	75,000 U for i.m. injection
Carprofen	Sigma-Aldrich	SML1713	5-10mg/kg, for s.c. injection
4% Paraformaldehyde (PFA)	Beijing Solarbio Sci-Tech Co.	P1110	stocking solution for tissue fixation
Phosphate buffer (PBS)	Invitrogen	10010023	pH7.4, 500ml in stocking
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura	4583	Formulation of water-soluble glycols and resins
anti-BrdU antibody	Abcam	ab6326	Dilutions:1/800
anti-c-fos antibody	Abcam	ab209794	Dilutions:1/500
Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568)	Thermo Fisher Scientific	A11036	Dilutions:1/500
Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488)	Jackson ImmunoResearch	712-546-150	Dilutions:1/500
Antifade mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Counterstaining with DAPI
anti-Notch1 antibody (C-20)	Santa Cruz Biotech	sc-6014	Dilutions:1/50
Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150073	Dilutions:1/1000