Na Vivo Microdialysis método para coletar grandes proteínas Extracellular do cérebro líquido intersticial com corte de alto peso molecular Probes
Summary
Na vivo microdialysis permitiu a coleção de moléculas presentes no líquido intersticial do cérebro (ISF) de animais acordados, se comportando livremente. Para analisar moléculas relativamente grandes no ISF, o atual artigo enfoca especificamente o protocolo microdialysis usando sondas com alto peso molecular, cortar as membranas.
Abstract
Na vivo microdialysis é uma técnica poderosa para coletar ISF de animais acordados, livremente-comportando-se com base em um princípio de diálise. Enquanto microdialysis é um método estabelecido que mede relativamente pequenas moléculas incluindo aminoácidos ou neurotransmissores, ela tem sido usada recentemente para avaliar também a dinâmica de moléculas maiores em ISF usando sondas com alto peso molecular, cortar membranas. Ao usar tais sondas, microdialysis tem de ser executado em um modo de encaixe para evitar pressão acumulada dentro as sondas. Este artigo fornece protocolos passo a passo, incluindo cirurgia estereotáxica e como configurar microdialysis linhas para coletar as proteínas do ISF. Durante microdialysis, medicamentos podem ser administrados sistemicamente ou por infusão direta no ISF. Microdialysis reversa é uma técnica para infundir diretamente compostos no ISF. Inclusão de drogas no buffer de perfusão microdialysis permite que eles se espalham ISF através de sondas, recolhendo simultaneamente ISF. Medindo a proteína tau, por exemplo, o autor mostra como seus níveis são alterados mediante estimulante atividade neuronal por microdialysis reversa de Picrotoxina. Vantagens e limitações do microdialysis são descritas juntamente com o aplicativo estendido pela combinação de outros métodos na vivo .
Introduction
ISF é composto por 15-20% do volume total do cérebro e oferece um microambiente crítica para a transdução de sinal, transporte de substrato e afastamento de resíduos1. Portanto, a capacidade de coletar ISF de animais vivos proporcionará maiores implicações para diversos processos biológicos, bem como o mecanismo da doença. Na vivo microdialysis é um dos poucos métodos que a amostra e quantificar extracelulares moléculas do ISF de acordado, movimentando-se livremente os animais e, assim, serve como uma ferramenta útil na neurociência pesquisa campo2,3. Neste método, microdialysis sondas com membrana semipermeável são inseridas no cérebro e perfundidas com perfusão na taxa de fluxo relativamente lento (0.1-5 µ l/min). Durante esta perfusão, moléculas extracelulares em ISF passivamente a sonda de acordo com o gradiente de concentração se espalham e recolher como um dialisato. Embora este artigo centra-se sobre o método a amostra ISF no cérebro, tanto o princípio e o método podem ser aplicados a outros órgãos por modificação apropriada se necessário.
Microdialysis primeiro foi empregado na década de 1960 e desde então ela tem sido extensivamente usada para coletar pequenas moléculas incluindo aminoácidos ou neurotransmissores no cérebro. No entanto, recente disponibilidade comercial do microdialysis sondas com alto peso molecular cortar membranas (100 kDa-3 MDa) estendeu sua aplicação às proteínas relativamente maiores no ISF, bem4,5,6 ,7. Os estudos usando estas sondas levou à constatação que proteínas como tau ou α-synuclein que há muito se julgava ser exclusivo citoplasmático também são fisiologicamente presente no ISF4,5,8.
Uma das dificuldades usando sondas microdialysis com grande corte de membranas (normalmente mais de 1.000 kDa) é que eles são mais suscetíveis à perda de líquidos ultrafiltração, devido à pressão interna acumulada nas sondas. Microdialysis sondas usadas aqui tem uma estrutura única para evitar esse problema. A pressão não irá ser construída devido a essa estrutura, assim microdialysis com estas sondas deve ser operado em um modo de “push-pull” usando uma bomba de seringa para perfundir as sondas (= impulso) e uma rolo/peristáltica para coletar a vinda do fluído da tomada da sonda (= puxar) 9 (embora precisa de push e pull de bombas, devido à pressão, cancelando os orifícios de ventilação, presente nas sondas, o sistema é tecnicamente apenas impulsionado pela bomba puxar). Este artigo começa com a cirurgia estereotáxica de uma implantação de cânula guia e descreve como criar linhas microdialysis para coletar ISF através das sondas microdialysis com 1.000 membranas de Cut-off de kDa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microdialysis com alto peso molecular, cortar as membranas tem que ser operado por um modo de encaixe, assim, é fundamental que a taxa de fluxo é precisa e constante. A imprecisão nas taxas de fluxo pode ser a causa da geração de bolhas de ar e inconsistência da concentração da amostra. Se o fluxo é inconsistente, verifique todas as conexões para detecção de fugas. Se o problema persistir, pode ser necessário para re-iniciar com tubulações e novas sondas.
Microdilaysis sondas co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela ‘ subsídio para a investigação científica em áreas inovadoras (cérebro proteína envelhecimento e demência Control)(15H01552) do MEXT e subsídio para jovens cientistas (B) (16K 20969). O autor agradece Dr. David M. Holtzman e Dr. John R. Cirrito para os conselhos técnicos durante o desenvolvimento deste método.
Materials
| The Univentor 820 Microsampler | Univentor | 8303002 | Refrigerated fraction collector |
| Syringe pump | KD scientific | KDS-101 | |
| Roller pump | Eicom microdialysis | ERP-10 | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1409 | Free-moving system |
| Dual species cage kit | BASi | CX-1600 | |
| AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm) | Eicom microdialysis | PEP-8-02 | Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical. |
| Microdialysis guide (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PEG-8 | |
| Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PED-8 | |
| Bone screw | BASi | MD-1310 | |
| Super bond C&B set | Sunmedical | Dental cement | |
| Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console | Kopf | Model 940 | Stereotaxic apparatus |
| Mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting | 51648 | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A7284-50ML | 30% BSA solution |
| FEP tubing (70 cm) | Eicom microdialysis | JF-10-70 | Internal volume = 0.5 µL/cm |
| Teflon tubing (50 cm) | Eicom microdialysis | JT-10-50 | Internal volume = 0.08 µL/cm |
| Byton tube | Eicom microdialysis | JB-30 | |
| Intramedic luer stab adaptor 23G | BD | 427565 | Blunt end needle |
| Roller tube | Eicom microdialysis | RT-5S | Internal volume = 4 µL |
| Cap nut | Eicom microdialysis | AC-5 | |
| 0.25 mL microcentrifuge tube with cap | QSP | 503-Q | Tubes for fraction collector |
| Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PESG-8 | |
| Connection needle | Eicom microdialysis | RTJ | |
| Mouse animal collar | BASi | MD-1365 | |
| High Speed Rotary Micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Drill |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| Screw driver for bone screws | |||
| Scalpel | |||
| Cotton swab | |||
| Surgical clipper |
References
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