这里提出的协议允许成年雄性黑阿古提大鼠的皮质半球广泛脱皮。该方法包括导管的内腔植入、骨髓寡细胞糖蛋白的亚临床免疫,以及通过植入导管对促炎细胞因子混合物的内腔注射。
多发性硬化症 (MS) 是中枢神经系统 (CNS) 最常见的免疫介导疾病,由脊髓和小脑的白质病变以及灰质脱髓引起的逐渐导致身体残疾和死亡。虽然实验性过敏性脑脊髓炎的传统模型适合研究脊髓和小脑白质中的细胞介导炎症,但它们不能解决灰质病理问题。在这里,我们提出了一种新的皮质脱叶大鼠模型的实验协议,允许对导致皮质病变的病理学和分子机制进行调查。脱皮是由低剂量骨髓细胞糖蛋白(MOG)免疫引起的,在不完整的Freund的辅助剂中,随后用导管介导的动脉内输送促炎细胞因子。此外,导管可进行多轮脱叶,而不会造成注射引起的创伤,以及进行临床前调查的可能治疗药物的腹腔内输送。由于动物疼痛、痛苦或残疾得到控制且相对较少,这种方法在道德上也是有利的。执行整个协议的预期时间约为8-10周。
MS是CNS的免疫介导,炎症性疾病,主要损害骨髓表,但最终导致轴向丧失和永久神经元损伤。根据国家MS协会1,MS是CNS最常见的免疫介质疾病,估计全世界约有230万人患病,是个人和社会经济的主要负担。疾病发病的平均年龄为30岁,导致严重残疾,导致生产年数的丧失。MS目前是无法治愈的,目前的治疗方式旨在管理复发性MS急性复发期间的症状,并通过免疫调节疗法2,3来改变疾病的疗程,以降低复发频率。除了最近对B细胞耗竭疗法的临床试验外,目前还没有证明对渐进型4的治疗方案有效,该疗法在活跃炎症5的初级渐进MS(PPMS)患者的亚组中被证明是有效的。虽然已经确定了几个潜在的遗传6和环境危险因素7,但MS的病因仍然未知。
MS的特点是大炎症脱叶斑块在,并扩散伤害,白质8,9。焦变与广泛的T细胞介导攻击、寡头细胞破坏、反应性星体胶质疏松和轴向退化有关,导致运动神经元下降。灰质脱皮和萎缩已得到承认,作为该病的其他组织病理特征9,10,11。后者已被建议促成神经功能障碍和认知衰退的患者12,13。皮质脱皮的三种模式已经得到区分,即:i) 白皮质,与白质病变(34%)相邻,ii) 小,近视(16%),和iii)亚皮质(50%)。与焦点白质病变不同,据报道这些灰质病变缺乏T细胞介质攻击,而是具有增强微胶质活化、凋亡和神经元损失12。
迄今为止,还无法在单一动物模型中重新概括人类MS,这主要是由于疾病的复杂性。各种MS动物模型,每个模拟疾病发病机理和进展的不同方面,相反,已经开发了14,15。目前的动物模型模拟三种不同的疾病过程:i) 焦炎病变,ii) 扩散性白质损伤,和 iii) 扩散性灰质病理学。
对MS白质斑块的动物研究大多在啮齿动物脑脊髓炎(EAE)模型中进行。试验动物积极免疫乳液含有骨髓抗原[通常骨髓细胞糖蛋白(MOG)16,17,骨髓基本蛋白(MBP)18,或蛋白蛋白(PLP)19],以及一个完整的氟德的辅助剂(CFA)20。这种疾病也可以被动地诱发通过采用转移骨髓特异性T细胞21。疾病过程取决于使用的抗原/小鼠菌株组合。例如,在C57BL/6中,MOG 35-55会导致单相慢性病22,而PLP139-151在瑞士吉姆兰伯特(SJL)小鼠导致复发性复发疾病课程23以性别特定的方式24。鼠MOG35-55,进一步诱导脑原性T细胞反应,而人类MOG35-55诱导C57BL/6小鼠25的B细胞依赖性炎症。各种EAE模型提供了一个很好的工具,研究细胞介导炎症主要在脊髓和小脑,但前脑结构,如皮层,语料库卡洛苏姆和皮下结构仍然基本上幸免于26。此外,在 EAE 型号26、27中,既没有扩散的白质损伤,也没有灰质脱化。与活性EAE诱导相关的皮质脱叶已报告在马莫塞特28,29和某些刘易斯鼠子菌株,在后一种情况下归因于MHC一级和II类同位素类型和等位基因30的普遍组合。
茶几模型31是研究弥漫性白质脱叶和灰质病理学的有用工具,具有广泛的皮质、亚皮质32和海马33区域,以及语料库卡洛苏姆34和烧碱普塔门35。Cuprizone中毒,原则上导致寡头细胞代谢应激诱发的凋亡,模仿MS大脑皮质脱髓病变的一些特征,如微胶质激活、天体胶质化和相对缺乏渗透的周围免疫细胞。然而,缺乏神经元凋亡和丘脑萎缩,以及完全解决脱髓与强大的再髓质观察停止饮食杯状素补充剂32,但是,限制了茶杯中毒作为临床前MS模型的使用。有毒脱叶剂也可以由将利索西丁或溴化物注射到白质36、37的白质区引起,但这些方法很少使用。毒性脱髓模型特别适合分析复髓的复杂机制,如寡核细胞祖细胞和星核细胞38,39的要求。关于EAE和醉酒模型的详细信息,在最近两次评论15,40中提供。
细胞因子诱发脱髓最初是为了研究EAE41中的脊髓白质病变而开发的。后来,它被修改为研究皮质灰质病理在M.黑暗阿古提(DA)或刘易斯大鼠首先由亚临床免疫与MOG1-12542,43或MOG1-11644在不完整的弗伦德的辅助(IFA)。与传统的 EAE 模型不同,这些原始动物不会表现出脊髓中焦点炎症病变的临床症状。相反,一旦动物在血液中获得了稳定的抗MOG抗体,大脑中的炎症反应和脱皮随后通过对促炎细胞因子混合物(肿瘤坏死因子α(TNF+)和干扰素伽马(IFN+)的内腔管理来实现。
默克勒 等人的研究。42 和加德纳 等人。44 已通过亚临床 MOG 免疫接种和腹腔内或亚拉氏细胞因子注射证明了亚皮质脱叶诱导的功效。然而,所报告的脱髓期太短,完全再骨髓化发生在14天或更短的时间内,从而限制了任何药理干预测试的窗口。此外,这两种模型都采用创伤性注射模式,这 本身 就可能导致注射创伤和血脑屏障(BBB)崩溃,从而导致炎症细胞不受控制地进入巴伦奇马。此外,这两项研究都表明,除化仅限于有限的区域、益普西拉特皮层或细胞因子注射部位附近。
为了克服这些限制,我们在DA大鼠的右皮层植入导管,导管尖位于体外。为了让BBB完整性完全恢复,允许动物在导管植入后休息2周。随后,这些大鼠在IMO中用5微克重组MOG1-125 进行亚临床免疫接种。大约4周后,在获得稳定的抗MOG抗体滴答声后,使用可编程注射器泵在10分钟内 通过 导管注射了2微升的细胞因子混合物。这个过程在15天内引起ipsi-和反脑半球的皮质脱髓,在细胞因子注射后30天左右出现部分再髓脱髓。此外,多重脱叶阶段可以通过导管反复施用促炎细胞因子来诱导,而全球脑萎缩,一种渐进性MS亚型45的常见特征,最早可能在第二个脱炎阶段43之后诱发。重要的是,植入的导管也可用于测试药理干预。
下文所述协议详细解释了使用内侧导管在DA大鼠的两个大脑半球中可重复产生广泛皮质脱叶的实验步骤。
我们的方法使用DA大鼠。适应小鼠可能需要使用较小的导管和螺丝。还应记住,如果使用不同的物种/菌株,疾病过程、炎症反应和脱叶程度可能与这里提出的不同。这种差异已经观察到与经典的EAE模型使用不同的小鼠菌株。例如,大鼠起源的MOG92-106 导致A.SW小鼠的原发性渐进或继生EAE,而它诱导SJL/J小鼠46的复发性EAE。因此,应使用相同菌株的动物。EAE表现中的性别差异也报告在各种以前的研究24。对于这里描述的协议来说,这种性别影响的发生很可能是预料之中的,但还有待进一步实验的验证。
麻醉剂混合物的腹膜(IP)管理包括0.02毫克/毫升芬太尼,0.4毫克/mL的米达佐兰,和0.2毫克/毫升的美甲酰胺用于手术干预。体重为270-300克的成年雄性DA大鼠需要大约0.4-0.6mL的这种混合物(即1.5mL/kg),以诱导持续60-90分钟的麻醉。手术后,麻醉通过皮下注射一种解毒剂,包括0.07毫克/毫升的氟苯和0.42毫克/毫升的阿提帕梅佐尔在生理盐水(0.9%NaCl)。剂量为1 – 1.5 mL/kg,在5分钟内对抗麻醉。或者,动物可以在麻醉剂的生理洗净后自发地醒来,但在这种情况下,动物需要被观察,直到他们完全清醒。
动物手术中常用的其他麻醉方案,如氯胺酮和西拉津47 或五巴比妥钠48的IP注射,或吸入挥发性麻醉剂,如异黄烷49 和光环烷50,也可以考虑在这里提出的手术。然而,选择不干扰预期下游干预的麻醉剂至关重要。
在免疫和腹腔细胞因子注射期间,5%异黄素用于麻醉。此处描述的模型是使用大鼠建立的,因此列出的实验细节特别适用于大鼠。选择了导管植入坐标,以便同时分析可能的白质变化(语料库卡洛苏姆中的导管尖端)。虽然导管插入部位可以因前体和横向位置而异,但中央磺化液的选择需要避免对上垂鼻窦的损害。
所述方法的另外一个特点是,无论是叶西半球还是反半球的等效脱叶,可能是由于从皮质区域51的间质流体的生理流动将注入的细胞因子混合物输送到亚拉希诺德空间。因此,注射模式,而不是导管的位置,会导致整个大脑皮层脱叶,因此,选择右或左皮层皮层在这方面应该无关紧要。
该协议使用26G导管,它足够小,以避免广泛的创伤性损伤,大到足以避免在实验的漫长过程中导管尖端堵塞率增加。当然,植入和导管本身的存在会导致星体细胞和微胶质活化,也只接受导管植入的对照动物:然而,与细胞因子注射动物相比,这是次要的。43 为了避免对后续分析有任何干扰,我们使用了由多乙醚醚酮 (PEEK) 制成的与 MRI 兼容导管。
事实上,在 ipsi 和反向区域中,使用呈现的方法创建了类似的分化深度。这意味着导管深度/长度可能不会在皮层脱皮的模式和程度中起主要作用。因此,可以考虑修改导管长度,以减少导管引起的病变大小。然而,导管长度明显缩短可能导致皮质脱位稍微不那么明显,而最终答案只能通过专门测试导管长度的实验获得。
该模型的一个优点是,植入导管允许测试 通过 导管管理到皮层的潜在治疗,允许在组织学上可检测的皮质脱髓(第15天或更晚)的高峰期或之后进行再髓化,而在预处理设置中,这将是在免疫接种后,但在细胞因子注射之前。因此,关于治疗时间框架的决定将取决于特定的研究问题和感兴趣的药物。
导管植入后,重要的是将动物单体安置在经过改良的(最好是高顶)笼子中,以避免导管切除,直到研究结束(图8)。动物也可能用入口拧开导管盖,尽管这种情况很少发生。应每天观察动物,取出的帽应替换为新鲜的,以避免在没有入口时导管尖端堵塞,并确保在腹腔注射后准确输送到帕伦奇马。这些动物最早在植入导管后2周接种疫苗,以便愈合和关闭血脑屏障。
免疫接种后应测量血清抗MOG抗体滴答声。剂量反应实验表明,5微克的MOG1-125(IFA) 在4周内为成年雄性DA大鼠提供了足够的免疫接种。5,000微克/mL及以上就足够了,但肯定取决于几个因素,包括MOG制备和动物菌株,因此,必须单独确定。重要的是要避免过高的抗原剂量可能导致一个经典的 EAE 表型与瘫痪的后肢,甚至在细胞因子注射之前。
每只动物接种5微克重组骨髓细胞糖蛋白(rMOG1-125)乳化在200μL不完整的弗伦德的辅助剂(IFA)。由于一些乳液在制备过程中会丢失在注射器内,因此建议为每只动物准备超过此量的乳液。我们使用重组MOG(1-125从大鼠MOG的N总站),这是在Escherichia大肠杆菌表达,然后被纯化成同质的夹层色谱,溶解在6M尿素,并透析对PBS获得生理准备52,53。但是,可能还会使用商用 MOG。
其他抗原制剂,如MOG1-116,MOG35-55或PLP139-151用于各种EAE模型,抗原和动物菌株的差异已知诱导这些模型20中不同的疾病表型。这些抗原制剂没有在DA大鼠身上测试,如果优先使用rmOG1-125,可能会诱发疾病表型或组织学结果与这里所呈现的结果不同。
在腹腔注射之前,准备了与导管长度相同的连接器管。这可以通过用模板导管组装并切割到相同尺寸(长度为2毫米)(图4)来完成。在细胞因子注射过程中,连接器管不能无气泡,因为注射体积只有2微升,即使是在管尖的微小气泡也会显著减少成功输送到大脑的液体体积。只有当尖端的注射液滴越来越多时,才能保持泵的运行和插入管子。插入管子后,连接器拧到导管上,同时避免过度紧固,以免损坏导管的上端,从而在注射后难以重新盖上。0.2 μL/min 的注射速度用于避免注射引起的创伤。此外,缓慢注射,加上注射后20分钟的等待期,可确保注射液体扩散到间歇性液体中,并有效排入CSF。然后慢慢去除管子以避免真空效应。
报告的方法包括手术干预,因此,要求工作人员能够进行立体定向生存手术。与动物直接接触的人员应参加适当的动物实验课程。协议的其余部分可以由称职的实验室成员执行。
该方法旨在产生炎症触发的脑皮层脱叶,不重现人类MS的所有特征(例如,焦点炎白质病变的发生,这是人类MS的标志)。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢格拉茨医科大学生物医学研究所的所有人员的帮助与合作,以及克里斯托弗·约翰·赖特恩对手稿的校对。
Adult male Dark Agouti rats (300 ±25 g) | |||
Fentanyl | Hameln pharma plus, Germany | as Fentanyl-Citrate, 50 µg/ml | |
Midazolam | ERWO Pharma, Austria | 50039017 | 5 mg/ml |
Medetomidin | Orion Pharma, Finland | as Medetomidin hydrochloride, 1mg/ml | |
Flumazenil | Roche, Switzerland | 0.1 mg/ml | |
Atipamezol | Orion Pharma, Finland | as Atipamezol hydrochloride, 5 mg/ml | |
10% povidone-iodine complex | Mundipharma, Austria | ||
Dental cement | Heraeus Kulzer, Germany | 6603 7633 | |
Physiological saline solution | Fresenius Kabi, Austria | 0.9% NaCl | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Germany | P3813 | |
Isofluorane | AbbVie, Austria | ||
Lubricating eye drops | Thea Pharma, Austria | ||
70% EtOH | Merck, Germany | 1070172511 | Absolute ethanol was diluted in ddH2O for preparation of 70% v/v |
2.5% enrofloxacin | Bayer, Germany | Prophylactic antibiotics | |
carprofen | Pfizer, USA | Painkillers, 50 mg/ml | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich, Germany | P9416 | |
Pentobarbital | Richter Pharma, Austria | pentobarbital sodium, 400 mg/ml | |
Interferon gamma | PeproTech, USA | 400-20 | |
Tumor necrosis factor alfa | R&D Systems, USA | 510-RT-050/CF | |
rMOG1-125 | own product at the Centre of Molecular Medicine, Karolinska Institute, Sweden | Recombinant rat myelin oligodendrocyte glycoprotein, amino acids 1-125 from the N-terminus, also commercially available: AnaSpec, AS-55152-500, USA | |
Anti-MOG antibody | Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan | AS-555157 | Standard from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka |
Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich, Germany | F5506 | |
Horse radish peroxidase conjugated anti-rat IgG secondary antibody | Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan | AS-555157 | Secondary Antibody from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka Corporation |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, Germany | A9576 | |
Peroxidase substrate solution | Vector Laboratories, USA | SK-45000 | |
Stereotactic frame | David Kopf Instruments, USA | ||
Catheters, MRI suitable | PlasticsOne, USA | 8IC315GPKXXC | |
Dummy cannulas | PlasticsOne, USA | 8IC315DCNSPC | |
Plastic screws, MRI suitable | PlasticsOne, USA | 8L080X093N01 | |
Connector cannula | PlasticsOne, USA | 8IC313CXSPCC | |
Screw driver with 2mm tip-size | |||
Drill with flexible shaft extension | Proxxon, Germany | NO 28 472, NO 28 706, NO 28 620, | |
Drill bit, round, 0.5 mm | Hager & Meisinger, Germany | REF310 104 001 001 009 | |
Drill bit, twisted, 1.3 mm | Hager & Meisinger, Germany | REF350 104 417 364 013 | |
Scalpel | Braun, Germany | BB510 | |
Scalpel handle | Fine Science Tools, Germany | 91003-12 | |
Cotton tip applicator | Henry Schein Medical, Austria | 900-3155 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools, Germany | 14101-14, 14088-10 | |
Surgical forceps | Fine Science Tools, Germany | 11002-12, 11251-35 | |
Bulldog clamps | Fine Science Tools, Germany | 18050-35 | |
Homoeothermic blanket | TSE systems, Germany | ||
Infrared Lamp | Beurer, Germany | 616.51 | |
Dental curing light | Guilin Woodpecker Medical, China | ||
Absorbable suture | Johnson & Johnson, Belgium | V792E | |
Programmable syringe pump | World Precision Instruments, USA | AL-1000 | |
Exam gloves | |||
Surgical gown | |||
Electric Shaver | Aesculap, Germany | GT420 | |
Volatile anesthetic vaporizer | Rothacher Medical, Switzerland | CV 30-301-D | |
Oxygen source for volatile anesthetic vaporizer | Air Liquide, Austria | 19,113 | |
Volatile anesthesia chamber | Rothacher Medical, Switzerland | PS-0347 | |
Anesthesia mask for rats | Rothacher Medical, Switzerland | PS-0307-A | |
1 ml syringe | Codan, Denmark | REF 62.1612 | |
26 Gauge needle for injection | Braun, Germany | 4657683 | |
20 Gauge needle for cytokine injection and immunization | Braun, Germany | 4657519 | |
Luer lock tip glass syringes | Poulten & Graf, Germany | 7.140-37 | |
3 way stopcock | Becton Dickinson, Sweden | 394600 | |
96-well plate | Thermo Fisher Scientific, USA | 442404 | |
Plate reader | Cole-Parmer, USA | EW-1396-00 | |
37°C incubator | Kendro, Germany | 50042301 | |
Micropipettes | Gilson, USA | F167350 |