生物发光细菌通过多种机制 (如聚类传感) 来调节光的产生。这种新方法允许对生物发光的原位研究和光发射与细胞密度的相关性。人工生物发光大肠杆菌系统允许对莱克丝操纵子、莱克丝蛋白及其相互作用的表征。
有相当多的细菌物种能够发射光。他们都有相同的基因簇, 即莱克丝操纵。尽管有这种相似之处, 这些细菌在生长行为、光发射强度或生物发光的调控等特性上表现出极端的变化。这里提出的方法是一个新的研究, 结合记录的细胞生长和生物发光光发射强度随着时间的推移, 利用一个板块阅读器。由此产生的生长和光发射特性可与各自细菌株的重要特征 (如仲裁传感调节) 联系起来。培养一系列的生物发光细菌需要一个特定的介质 (例如,人工海水介质) 和定义的温度。另一方面, 易于处理的非生物发光标准研究细菌大肠杆菌 (大肠杆菌)可以在实验室规模内以较高的数量进行廉价栽培。通过引入含有整个莱克丝操纵的质粒来开发大肠杆菌可以简化实验条件, 另外还为将来的应用开辟了许多可能性。通过吉布森克隆和插入四块含有七莱克丝基因和三根肋骨基因的表达质粒, 实现了利用大肠杆菌表达菌株的所有莱克丝基因的表达。莱克丝肋操纵成 pET28a 向量。大肠杆菌基的莱克丝基因表达可以诱导和控制通过异丙基β-thiogalactopyranosid (IPTG) 添加导致生物发光大肠杆菌细胞。该系统的优点是避免了仲裁传感调节限制和复杂介质组成以及非标准生长条件, 如定义的温度。该系统能够分析莱克丝基因及其相互作用, 通过排斥操纵的相应基因, 甚至添加新的基因, 将luxAB基因从一个细菌菌株交换, 或分析蛋白质复合物, 如luxCDE。
生物体的光的发射 (生物发光) 是一个迷人的过程中发现细菌, 真菌, 昆虫, 线虫, 鱼类和鱿鱼1。生物发光光的发射来自于化学能量 (部分地) 转化为光能 (“冷光”) 的化学反应。在生物发光细菌中, heterodimeric 酶荧光素催化 monooxygenation 长链, 脂肪醛, 如 tetradecanal, 到相应的酸伴随着光发射最大值在 490 nm2,3。
图 1: 细菌荧光素酶的一般反应方案.细菌荧光素酶 (LuxAB) 通过利用黄素单核苷酸 (FMNH2) 和分子氧 (O2) 催化 monooxygenation 长链醛 (ch3(ch2)), 产生产物长链酸 (ch3(ch2)nCOOH), 黄素单核苷酸 (FMN), 水 (H2O) 和光的发射以 490 nm 为中心。请单击此处查看此图的较大版本.
在这种氧化过程中释放的能量会引起兴奋状态 FMN-4a-hydroxide, 它作为发光荧光素4。细菌生物发光所涉及的蛋白质, 即 LuxCDABEG,是由莱克丝操纵编码的, 并且高度保守于各种细菌菌株2,5。heterodimeric 荧光素酶的基因luxA和luxB编码;luxC、 luxD和奢侈品的基因产品是脂肪酸还原酶复合物的组成部分;luxG编码为黄素还原酶6。一些生物发光发光细菌(例如, 发光 mandapamensis 27561) 携带额外的luxF基因。据报道, LuxF 是一种 homodimeric 蛋白, 它结合了不寻常的黄素衍生物 6-(3 ‘-(R)-肉豆蔻)-FMN (myrFMN)7,8,9,10,11 ,12。还发现了对核黄素合成负责的其他基因 (例如, ribEBH), 而且还报告了调控基因, 这在生物发光的仲裁传感调控中起到了作用, 特别是对弧菌鲵和弧菌弧菌6,13。尽管高度保守的基因秩序, 生物发光细菌表现出高变化的特点, 如生长行为, 光强辐射, 或调节生物发光2,5,14.
一些含有部分或整个莱克丝操纵子的改良菌株或质粒是众所周知的, 利用生物发光作为记者系统。各种应用, 如确定启动子活动, 监测环境或食品样品中的细菌污染, 生物荧光共振能量转移 (),在体内成像的真核生物感染,pyrosequencing, 等等建立了15,16,17。有趣的是, 三最常用的生物发光报告系统来自北美萤火虫 (Photinus pyralis), 线虫的肠道病原体 (Photorhabdus luminescens) 和海的三色堇 (Renillareniformis)。这些系统都没有细菌起源, 但是使用莱克丝基因和操纵子从细菌起源获得更多的兴趣应用研究16。生物发光蛋白在细菌来源中的应用较少, 主要是由于细菌衍生的发光蛋白的稳定性和寿命较短, 与海洋生境有关。在标准实验室条件下, 海洋生境的生物发光细菌是不可耕种的。这些细菌需要特定的生长介质和条件, 如人工海水介质和较低的生长/孵化温度 (例如, 28 摄氏度)。
为了简化对不同生物发光细菌株的莱克丝操纵特征或单一莱克丝基因的比较, 一种规范莱克丝操纵表达和分析的方法是先决条件。因此, 将整个莱克丝肋操纵纳入标准研究细菌大肠杆菌 (大肠杆菌) 的想法应运而生 .为此, 吉布森装配被证明是一个有用的工具, 将多个线性, 重叠片段集成到一个表达式向量中, 而不需要特定的限制站点。当 DNA 插入量过大 (例如, mandapamensis 27561 luxCDABFEG-ribEBH; ~ 9 kb 操纵大小) 时, 该方法也适用于通过 PCR 扩增。莱克丝操纵可以分离成多个重叠片段, 然后组装成一个表达质粒, 最后序列验证的组装产品可以直接转化为适当的大肠杆菌系统高产蛋白质表达18,19,20。除了易于处理大肠杆菌的莱克丝基因表达, 一个简单的方法, 结合记录的细胞生长和生物发光光发射仍然有待建立。这里描述的方法允许原位测量和相关的细胞密度和光发射的生物发光细菌。
对莱克丝基因和莱克丝操纵的分析, 并对各种生物发光细菌进行了调控, 一方面是含有操纵的人工生物发光大肠杆菌系统 。mandapamensis 27561, 另一方面, 新开发的平板阅读器检测结合原位记录细胞密度和光发射, 有助于获得更多的信息, 各种细菌莱克丝系统。这种基本的特征和比较 luciferases 和相关的酶可能会导致替代已建立的记者系统, 增强稳定性和活性。
通过吉布森克隆, 构建了一个含有四个片段组成 mandapamensis 27561 的操纵的表达质粒。这种基于大肠杆菌的莱克丝基因表达使大肠杆菌细胞发出光。避免仲裁传感调节和非标准生长条件是该系统的重要优点。
使用吉布森克隆策略的优点是易于组装多线 DNA 片段, 灵活性高, 不需要特定的限制站点18,19,20。这种方法可以很容易地改变一个莱克丝操纵, 不包括单一基因或基因簇, 或引入新的基因或交换基因从一个菌株与另一个。应用此方法的先决条件是各自的莱克丝操纵基因序列的可用性。仅为少量发光的细菌是完全脱氧核糖核酸序列各自莱克丝操纵知道并且/或者可利用。这些序列中的许多都是碎片, 因为它们是使用猎枪测序生成的。在被调查的P. mandapamensis 27561 的情况下,莱克丝操纵的完整 DNA 序列是已知的, 可从 NCBI 基因数据库 (基因库: DQ988878.2) 获得。
吉布森装配协议的一个关键步骤是计算单个碎片的 DNA 浓度。在制造商的装配协议, 建议使用 0.2-0.5 pmols 和总容量20µL 为 4-6 片断20,21。在本例中, luxCDABFEG-ribEBH由4个片段组成, 其浓度和总体积分别为 0.1 pmol 和45µL, 这取决于 PCR 产物的产量。一方面, 集中度必须减少, 另一方面, 必须增加体积。然而, 大会工作非常顺利, DNA 测序确认正确插入的第一次尝试。这一发现证实吉布森大会是一个稳健和适当的方法, 我们的调查, 可以很容易地修改18,19,20。
新建立的板读法是一种易于处理的方法。它可以对新的或 (非) 已知的生物发光细菌菌株进行简单的初步分析, 并给出了关于光生产调控机制的第一个提示 (例如,低细胞密度下的发光滞后)。此外, 通过简单地改变生长介质或温度, 可以很容易地评价生长条件与光生产的结合。
测量与板材读者被执行了在28°c。这种不寻常设置的原因是生物发光细菌菌株的温度敏感性, 温度高于30摄氏度会导致更少甚至没有生长和/或光发射。注意, 板读器能够保持一个定义的温度随着时间的限制, 一个缺少的有源冷却系统。因此, 环境温度必须低于测量的温度。
作为概念的证明, 对大肠杆菌结构与生物发光应变P. mandapamensis (图 5) 进行了比较, 同时进行了参考测量 (图 4), 并确认了这个新建立的系统的可靠性。此外, 长期测量还保证了光发射的寿命 (图 6)。但人们必须考虑到, OD 值在一定的光学密度之上是不可靠的, 这取决于使用的测量装置的特点 (在本例中约15小时), 在这种情况下需要适当的稀释来测量探测器的线性范围。这些高方差的 OD 值使得这些长时间的测量不可靠。因此, 建议使用此处报告的实验装置, 以缩短10小时的测量量。
在图 7中可以看到已建立的平板阅读器检测的局限性。难点是要找到适当的测量设置。”增益值” 调整光电倍增管 (PMT) 的灵敏度。增益是 PMT 中信号的放大, 这意味着较高的增益因数会增加信号。如果增益设置得过低, 信噪比越大, “低” 发光细菌的光强度就不能再测量 (接近零的信号, 没有显示的数据)。生物发光检测的挑战是设置增益, 使所有细菌菌株的测量结果停留在仪器的范围内。另外, 发光的测量范围取决于测量间隔时间 (例如,最大值为 200万, 1 秒)。
该增益设置为 2800, 经经验检验, 并选择用于建立此方法的特定板读取器。使用增益设置允许记录的最大发射光的生物发光大肠杆菌系统, p. mandapamensis 27561 和mandapamensis S1 没有溢出, 但为菌株P. mandapamensis TH1 和五. 弧菌14126 的增益太高。因此, 这些后应变超过检测极限, 真正的最大光强度是无法测量的。这种技术限制可能会阻止生物发光细菌的比较, 因为它们在最大光发射中表现出很高的变化, 尽管生长条件和细胞密度可能是可比的。
在用过的井板中分析的细菌菌株的定位必须进行实证评估。虽然使用了玻璃底的黑色井板, 样品之间的串扰被观察了。特定菌株的光强程度如此之高, 所有邻近的油井都将显示假的正光排放 (如空白)。因此, 对两种不同的菌株进行单独的测量或与某种空间的分离是很重要的。
已经有许多被修改过的大肠杆菌菌株, 其中含有莱克丝操纵的部分, 主要以应用为导向的15,16,17。这里描述的方法, 瞄准基础研究, 例如可能单独地分析每莱克丝基因。虽然生物发光研究有很长的历史, 但仍存在许多开放性问题。通过排除或引入莱克丝操纵的基因, 将luxAB基因与另一种菌株的基因交换, 或分析蛋白质复合物, 嵌入在易于处理的大肠杆菌系统中, 并进一步应用于板材读者分析, 也许可以获得更多的信息, 管理过程和功能的莱克丝基因。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢 Wladislaw Maier (BMG Labtech 有限公司) 为他的支持, 为板阅读器建立自写脚本。这项工作由奥地利 “全宗 zur Förderung wissenschaftlichen 研究” (FWF) 到 pm (P24189) 和博士项目 “DK 分子酶学” (W901) 支持 pm。
NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs Inc. | E2621S | for 10 rxn dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad |
Phusion Polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
Q5 High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs Inc. | M0491S | |
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