Bactérias bioluminescentes produçãode luz através de uma variedade de mecanismos, tais como detecção de quórum. Este novo método permite que a investigação em situ de bioluminescência e a correlação de emissão de luz a densidade celular. Um artificial bioluminescentes Escherichia coli sistema permite a caracterização de operons lux , Lux proteínas e sua interação.
Há um número considerável de espécies bacterianas capaz de emitir luz. Todos eles compartilham o mesmo cluster de gene, ou seja, o operon lux . Apesar dessa semelhança, estas bactérias mostram variações extremas em características como comportamento de crescimento, intensidade de emissão de luz ou regulamento de bioluminescência. O método apresentado aqui é um ensaio recentemente desenvolvido que combina gravação de crescimento celular e a intensidade de emissão de luz bioluminescente ao longo do tempo, utilizando um leitor de placa. O resultante crescimento e características de emissão de luz podem ser vinculadas a características importantes da estirpe bacteriana respectivo, tais como quórum de sensoriamento do regulamento. O cultivo de uma variedade de bactérias bioluminescentes requer um meio específico (por exemplo, meio de água do mar artificial) e definido de temperaturas. O fácil de manusear, não-bioluminescentes padrão-pesquisa bactéria Escherichia coli (e. coli), por outro lado, pode ser cultivado barata em grandes quantidades em escala de laboratório. Explorando a e. coli através da introdução de um plasmídeo contendo o inteiro lux operon pode simplificar as condições experimentais e adicionalmente abre muitas possibilidades para futuras aplicações. A expressão de genes de lux todos utilizando uma cepa de expressão de Escherichia coli foi conseguida através da construção de um plasmídeo de expressão através de clonagem de Gibson e inserção de quatro fragmentos contendo sete genes lux e três genes costela de o operon lux-costela em um vetor de pET28a. Expressão do gene de e. coli com base lux pode ser induzido e controlado através da adição de isopropil-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG), resultando em bioluminescentes Escherichia coli células. As vantagens deste sistema são evitar quorum sensing Regulamento restrições e composições complexas de médio juntamente com as condições de crescimento não-padrão, tais como definidas temperaturas. Este sistema permite a análise de genes de lux e sua interacção, a exclusão do respectivo gene o operon lux , ou mesmo adição de genes novos, trocando os genes luxAB de uma estirpe bacteriana por outra, ou Analisando a complexos de proteínas, tais como luxCDE.
A emissão de luz por organismos vivos (bioluminescência) é um processo fascinante encontrado em bactérias, fungos, insetos, nematoides, peixes e lulas1. Emissão de luz bioluminescente emerge uma reação quimioluminescente, no qual a energia química (parcialmente) é transformada em energia luminosa “(luz fria”). Em bactérias bioluminescentes, o heterodimérica luciferase de enzima catalisa a monooxygenation de cadeia longa, aldeídos alifáticos, tais como tetradecanal, para os correspondentes ácidos acompanhada de emissão de luz com um máximo em 490 nm2, 3.
Figura 1 : Esquema de reação geral da luciferase bacteriana. A luciferase bacteriana (LuxAB) catalisa a monooxygenation de cadeia longa aldeídos (CH3(CH2)nCHO) utilizando reduziram o mononucleótido de flavina (FMNH2) e oxigênio molecular (O2), produzindo os produtos de cadeia longa ácidos (CH3(CH2)nCOOH), o mononucleótido de flavina (FMN), água (H2O) e a emissão de luz centrado em 490 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A energia liberada durante esta oxidação provoca um estado excitado FMN-4a-hidróxido, que serve como a luz emitindo luciferina4. As proteínas envolvidas na bioluminescência bacteriana, ou seja, LuxCDABEG, são codificados pelo operon lux e são altamente conservadas ao longo de várias estirpes bacterianas2,5. Os genes luxA e luxB codificam para o luciferase heterodimérica; produtos de gene do luxC, do luxDe do luxo são componentes de uma ácido graxo redutase complexa; e luxG codifica para uma flavina redutase6. Um número de bioluminescentes Photobacteria (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) carregam o gene adicional luxF . Foi relatado que LuxF é uma proteína homodimeric que vincula a flavina incomum derivado 6-(3′-(R)-miristílico)-FMN (myrFMN)7,8,9,10,11 ,12. Foram identificados genes adicionais que são responsáveis pela síntese de riboflavina (por exemplo, ribEBH) e além dos genes regulatórios foram relatados, que desempenham um papel no Regulamento sensoriamento de quórum de bioluminescência, especialmente para Vibrio fischeri e Vibrio harveyi6,13. Apesar da ordem de gene altamente conservadas, bactérias bioluminescentes mostram altas variações nas características como comportamento de crescimento, intensidade de emissão de luz, ou regulamento de bioluminescência2,5,14 .
Vários modificado estirpes ou plasmídeos contendo partes ou toda lux operons são conhecidos, explorando a bioluminescência como sistemas de repórter. Diversas aplicações tais como determinar a atividade de promotor, monitoramento de contaminações bacterianas no ambiente ou amostras de alimentos, bioluminescência ressonância energia transferência (BRET), imagem latente na vivo de infecções em organismos eucarióticos, Pyrosequencing e assim por diante foram estabelecidas15,16,17. Curiosamente, os três mais frequentemente utilizado repórter bioluminescente sistemas derivam o vaga-lume-norte-americano (Fotino pyralis), o patógeno entérico de nemátodos (Photorhabdus luminescens) e o falsário de mar (Renilla reniformis). Nenhum desses sistemas tem uma origem bacteriana, mas a utilização de genes de lux e operons de origem bacteriana está ganhando mais interesse para a investigação aplicada,16. O aplicativo menos abundante de proteínas de bioluminescência de fontes bacterianas é principalmente devido à menor estabilidade e longevidade de bactérias derivados luminescentes proteínas que podem estar relacionadas com os habitats marinhos. Bactérias bioluminescentes de habitats marinhos não são cultiváveis em condições de laboratório padrão. Estas bactérias exigem meios de crescimento específico e condições, tais como mar artificial crescimento/incubação médio e baixa a temperatura da água (por exemplo, 28 ° C).
Para simplificar a comparação das características de operon lux ou único lux genes de uma gama de diferentes estirpes de bactérias bioluminescentes, um método para padronizar a análise e expressão do operon lux é um pré-requisito. Assim, surgiu a ideia de integrar o operon lux-costela de toda a pesquisa padrão-bactéria Escherichia coli (e. coli). Para este efeito, montagem Gibson provou para ser uma ferramenta útil para integrar múltiplos fragmentos sobrepostos, lineares vector de uma expressão sem a necessidade de sítios de restrição específica. Esse método também é apropriado quando as inserções de ADN são muito grandes (e.g.,P. mandapamensis 27561 luxCDABFEG-ribEBH; ~ tamanho de operon 9KB) para ser amplificado através do PCR. Um operon lux pode ser separado em múltiplos fragmentos sobrepostos e, em seguida, ser montada em plasmídeo de um expressão e finalmente a sequência verificada produto de montagem pode ser diretamente transformado em um apropriado Escherichia coli sistema para alto rendimento expressão da proteína18,19,20. Além de fácil lidar com a expressão do gene de e. coli com base lux , um método simples, combinando gravação do crescimento celular e emissão de luz bioluminescente permaneceu para ser estabelecida. O método descrito aqui permite a medição em situ e correlação da densidade celular e emissão de luz de bactérias bioluminescentes.
A análise de genes de lux e ordem de operon lux e regulamento de várias bactérias bioluminescentes com, por um lado, um artificial bioluminescentes Escherichia coli sistema contendo o operon toda lux-costela de P. mandapamensis 27561 e, por outro lado, um ensaio de leitor de placa recentemente desenvolvido combinando a gravação em situ da densidade celular e emissão de luz, ajuda a obter mais informações sobre os diversos sistemas de bacteriana lux . Esta caracterização fundamental e comparação de luciferases e enzimas relacionadas podem levar a alternativas para os sistemas de repórter já estabelecido com atividade e estabilidade melhorada.
A construção de um plasmídeo de expressão contendo quatro fragmentos compondo o operon toda lux-costela de mandapamensis p. 27561 foi conseguida através de clonagem de Gibson. Esta expressão de gene de lux Escherichia coli baseado permite que células de Escherichia coli a emitir luz. Evitar o quórum sensoriamento regulamento e condições de crescimento não-padrão é substanciais vantagens deste sistema.
As vantagens de usar a estratégia de clonagem Gibson são a fácil montagem de vários fragmentos de DNA lineares, alta flexibilidade e sem necessidade de restrição específicas sites18,19,20. Este método permite alterar facilmente um operon lux , excluindo os genes único ou clusters de gene ou introduzindo novos genes ou intercâmbio de genes de uma estirpe com outro. Um pré-requisito para a aplicação deste método é a disponibilidade da sequência do gene de operon respectivos lux . Apenas para um pequeno número de bactérias bioluminescentes é a sequência de DNA completa do respectivos lux operon conhecidos e/ou disponível. Muitas dessas sequências são fragmentadas porque eles foram gerados usando o sequenciamento de espingarda. No caso do inquérito mandapamensis p. 27561 a sequência de DNA completa do operon lux é conhecido e disponível a partir do banco de dados do NCBI gene (GenBank: DQ988878.2).
Um passo crítico no protocolo da Assembleia Gibson é o cálculo da concentração de DNA dos fragmentos único. No protocolo de montagem do fabricante foi recomendado usar 0,2 – 0,5 pmoles e um volume total de 20 µ l para 4-6 fragmentos20,21. No nosso caso, onde luxCDABFEG-ribEBH é composto de 4 fragmentos, as concentrações e volumes totais foram pmol 0.1 e 45 µ l, respectivamente, dependendo do rendimento dos produtos PCR. Por um lado, a concentração teve de ser reduzido, e por outro lado, o volume teve que ser aumentada. No entanto, a Assembleia funcionou muito bem e sequenciamento de DNA confirmou a inserção correta na primeira tentativa. Este achado confirmado montagem Gibson como um método robusto e apropriado para nossas investigações, o que pode ser facilmente modificado18,19,20.
O ensaio de leitor de placa recém-criada é um fácil de lidar com o método. Permite uma análise simples primária de novo ou (un-) conhecido estirpes de bactérias bioluminescentes e dá já uma primeira dica sobre o mecanismo regulatório de produção de luz (por exemplo, atraso na luminescência em densidades de pilha baixa). Além disso, as condições de crescimento em combinação com a produção de luz facilmente podem ser avaliadas simplesmente mudando o meio de cultura ou temperatura.
Foram realizadas as medidas com o leitor a 28 ° C. A razão para esta configuração incomum é a sensibilidade de temperatura de estirpes de bactérias bioluminescentes, onde as temperaturas acima de 30 ° C conduzem a menos ou até mesmo nenhum crescimento e/ou emissão de luz. Note que o leitor é capaz de manter uma temperatura definida ao longo do tempo com a limitação da falta de um ativo sistema de arrefecimento. Portanto, a temperatura ambiente deve estar abaixo da temperatura da medição.
Como uma prova de conceito, a comparação da construção de e. coli com a cepa bioluminescente p. mandapamensis (Figura 5), por um lado e as medições de referência (Figura 4) por outro lado foram realizadas e confirmar a confiabilidade deste sistema recém-criada. Além disso, a longo prazo medida garantiu a longevidade da emissão de luz (Figura 6). Mas deve-se considerar que os valores de OD não são fiáveis acima de uma certa densidade óptica, dependendo das características do dispositivo de medição utilizado (aproximadamente 15 h no presente caso) onde seria necessário uma diluição adequada para uma medição na escala linear do detector. Estes desvios altos nos valores de OD fazem estas medições de tempo não confiável. Portanto, medições mais curtas como 10 h são recomendadas usando a configuração experimental relatou aqui.
Limitações do ensaio do leitor de placa estabelecida podem ser vistas na Figura 7. A dificuldade é encontrar uma configuração apropriada da medição. O valor de ‘ganhar’ ajusta a sensibilidade do tubo foto multiplicador (PMT). O ganho é a amplificação do sinal no PGTO, significando que um fator de ganho mais elevado aumentará o sinal. Se o ganho é definido muito baixo, relação sinal / ruído torna-se maior e intensidades luminosas de bactérias bioluminescentes brilhantes “baixas” não podem ser medido qualquer (sinais mais próximo de zero, dados não mostrados). O desafio em um ensaio bioluminescente é ajustar o ganho para que os resultados de medição para todas as estirpes bacterianas fiquem dentro da escala do instrumento. Além disso, o intervalo de medição para luminescência varia de acordo com o tempo de intervalo de medição (por exemplo, máximo de 2.000.000 para 1 s).
O ganho foi definido como 2800, empiricamente, que foi testado e escolhido para o leitor de placa específicos utilizado para o estabelecimento deste método. O ajuste de ganho utilizado permite a gravação de máxima luz emitida pela bioluminescentes sistema de Escherichia coli , mandapamensis p. 27561 e p. mandapamensis S1 sem um estouro, mas para as tensões TH1 p. mandapamensis e V. harveyi 14126 o ganho era muito alto. Portanto, estas variedades último excederem o limite de detecção e a intensidade da luz real máxima não pode ser medida. Essa limitação técnica pode impedir que a comparação de bactérias bioluminescentes, que mostram variações altas em emissão de luz máxima, embora as condições de crescimento e as densidades de célula podem ser comparáveis.
Posicionamento das cepas bacterianas analisadas dentro as placas bem usadas tem de ser avaliada empiricamente. Apesar de placas bem pretas com fundo de vidro foram usadas, crosstalk entre as amostras foi observada. A intensidade da luz de cepas específicas é tão elevada, que todos os poços vizinhos mostrará falsas positivas luz das emissões (por exemplo, em branco). Portanto, é importante medir duas linhagens diferentes separadamente ou com uma certa separação espacial uns aos outros.
Já existem muitos modificado cepas de e. coli conhecidas que contêm partes do operon do lux e são principalmente orientada a aplicação15,16,17. Os métodos descritos aqui, visam a investigação fundamental, por exemplo, a possibilidade de analisar cada gene lux separadamente. Embora pesquisas da bioluminescência tem uma longa história, há ainda muitas questões abertas. Excluindo ou introduzir genes do operon do lux , troca de genes com genes de outra estirpe luxAB ou analisando proteínas complexos, incorporado no fácil de lidar com o sistema de e. coli e ainda mais a aplicação da placa ensaio do leitor, é possível obter mais informações sobre processos regulatórios e as funções dos genes de lux .
The authors have nothing to disclose.
Queremos agradecer Wladislaw Maier (BMG Labtech GmbH) pelo seu apoio no estabelecimento o script auto escrito para o leitor. Este trabalho foi apoiado pelo austríaco “Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen pesquisa” (FWF) para PM (P24189) e o programa de doutoramento “DK Molecular enzimologia” (W901) para PM.
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