Denne protokollen beskriver fremgangsmåten for å utforme og utføre multiplex målretting av enhancers med deaktivering fusion protein SID4X-dCas9-KRAB, også kjent som forsterker interferens (Enhancer-i). Dette aktiverer identifisering av enhancers som regulerer genuttrykk og forenkler Disseksjon av relasjoner mellom enhancers regulere et felles mål-gen.
Flere enhancers regulere ofte et bestemt gen, men for de fleste gener, det er fortsatt uklart hvilken enhancers er nødvendig for genekspresjon, og hvordan disse enhancers kombineres for å produsere transcriptional svar. Som millioner av enhancers identifisert, er høy gjennomstrømming verktøy nødvendig å bestemme enhancer funksjon på en genomet-bred skala. Gjeldende metoder for å studere enhancer funksjonen inkluderer gjør genetisk slettinger bruker nuclease-dyktige Cas9, men det er vanskelig å studere kombinasjon virkningene av flere enhancers bruker denne teknikken, som flere påfølgende klonal cellelinjer må generert. Her presenterer vi Enhancer-i, en CRISPR forstyrrelser-basert metode som tillater funksjonelle avhør av flere enhancers samtidig på deres endogene loci. Enhancer-jeg gjør bruk av to undertrykkende domener del nuclease dårlig Cas9, SID og KRAB, for å oppnå enhancer deaktivering via histone deacetylation på målrettet loci. Denne protokollen utnytter forbigående transfection av guide RNAs aktivere forbigående inaktivering av målrettede regioner og er spesielt effektiv på blokkerer induserbart transcriptional svar på stimuli i vev kultur innstillinger. Enhancer-jeg er svært spesifikke både i genomisk målrettingen og dens virkning på globale genuttrykk. Resultatene fra denne protokollen hjelp til å forstå om en enhancer bidrar til genuttrykk, omfanget av bidrag og hvordan bidraget påvirkes av andre nærliggende enhancers.
Store sekvensering prosjekter som kode1, veikart Epigenomics2og FANTOM3 har identifisert millioner av antatte enhancers i det menneskelige genomet på hundrevis av celletyper. Det anslås at hver promoter knytter gjennomsnitt 4,9 enhancers og hver enhancer kontakter gjennomsnittlig 2,4 gener3, antyder at genuttrykk er ofte et resultat av integrasjonen av flere distribuert juridiske interaksjoner. En betydelig gjenværende utfordring er å definere ikke bare hvordan individuelle enhancers bidra til genuttrykk, men hvordan de kombineres for å påvirke uttrykk. Genetiske metoder brukes ofte til å identifisere relasjoner mellom enhancers i modellen organismer fra Drosophila4 mus5. Disse eksperimentene er imidlertid tidkrevende og lav gjennomstrømming for studier av flere enhancers på flere gener.
En tilnærming for å studere enhancer funksjon i stor skala innebærer massivt parallelle reporter analyser. Disse analyser tillate samtidig screening av DNA-sekvenser for sin evne til å kjøre uttrykk for en reporter genet6. Mens disse analyser har vist at DNA sekvensen alene kan være nok til å formidle genet regulering informasjon7, kommer de med begrensningene av utføres enhetskontroll opprinnelige chromatin og en heterologous promoter. I tillegg er størrelsen på DNA sekvensen blir analysert i massivt parallelle reporter analyser vanligvis mindre enn 200 basepairs, som kan utelukke relevante omkringliggende sekvens. Viktigere, som reporter analyser bare måle aktiviteten til en sekvens samtidig, tar de ikke hensyn til komplekse forhold som finnes mellom enhancers. Dermed mens massivt parallelle reporter analyser kan være informativ om iboende aktiviteten til en DNA sekvens, de ikke nødvendigvis informere oss om funksjonen til den DNA sekvensen i sammenheng med genomet.
Nylig lettet utviklede CRISPR/Cas9 tools8 studiet av genet regulering som de tillater for sletting av enhancers på endogene locus. Imidlertid slette flere enhancers samtidig kan føre til genomisk ustabilitet, og det er tidkrevende å generere påfølgende enhancer slettinger i en enkelt celle linje. I tillegg opprettes nye genomisk rekkefølgen på stedet for sletting etter reparasjon, og denne sekvensen kan få regelverket. En alternativ versjon av Cas9 er utviklet spesielt for modulerende genuttrykk, stole på fusjoner aktivere9,10 eller repressing11,12 domener til nuclease dårlig form av Cas9 (dCas9). Disse fusion proteiner er ideelle for å studere flere loci samtidig som de gjør ikke fysisk endre DNA sekvensen, og i stedet modulerer epigenetics for å avhøre en regulerende region. Den mest brukte undertrykkende fusion er KRAB, som rekrutterer KAP1 co repressor komplekset, fremme avsetning av undertrykkelse-assosiert histone H3 lysin 9 trimethylation (H3K9me3)13. dCas9-KRAB, også kjent som CRISPR forstyrrelser14, har vært brukt til målet og skjermen personlige enhancers for deres bidrag til gene expression15,16. men har det ikke blitt optimalisert for å målrette flere områder samtidig. En versjon av multiplex CRISPR forstyrrelser for enhancers, mosaikk-seq17, bruker enkeltcelle RNA-seq som en presentasjon, men denne teknologien er dyrt og bare egnet for studiet av svært uttrykt gener på grunn av lav følsomheten av enkelt celle RNA-seq.
Vi søkt å utvikle en CRISPR forstyrrelser-basert metode for dissekere kombinasjon enhancer funksjon innenfor rammen av transcriptional svar til østrogen. Omtrent halvparten av østrogen responsive gener inneholder 2 eller flere enhancers bundet av østrogen reseptor alfa (ER) i nærheten18, antyder at flere enhancers kan delta i estrogen svaret, og forstå regulatoriske logikken ville kreve rettet mot flere enhancers samtidig. Som første studier med CRISPR forstyrrelser på arrangører foreslo at ikke alle arrangører er like lydhør overfor KRAB-mediert undertrykkelse19, tenkte vi at tillegg av en distinkt undertrykkende domenet dCas9 kan lette deaktivering av mangfoldig enhancers. Vi valgte Sin3a samspill domenet av Mad1 (SID)20 som fører til rekruttering av histone deacetylases21, som fjerner acetyl grupper på histones som er forbundet med transcriptional aktivitet. Viktigere, SID domenet var effektivt redusere genuttrykk da smeltet dCas922 og TALEs23, og Sin3a har vist seg å være en potent undertrykkende co-faktor i en rekke enhancer sekvens sammenhenger24. Vi brukte SID4x-dCas9-KRAB (Enhancer-i) for å målrette 10 forskjellige enhancers bundet av ER, og identifisere ER bindende områder (ERBS) som er nødvendige for østrogen transcriptional svaret 4 gener18. Vi har også målrettet kombinasjoner av enhancers å identifisere nettstedene som samarbeider i produksjon av østrogen transcriptional svaret. Vi fant at opp til 50 steder kan potensielt være målrettet samtidig med synlig gene expression endringer. Bruke ChIP-seq og RNA-seq, vist vi at Enhancer-jeg er en svært spesiell teknikk for å studere flere enhancers samtidig.
I denne protokollen beskriver vi trinnene involvert i å utføre Enhancer-i, en fleksibel teknikk som muliggjør funksjonelle studiet av flere enhancers samtidig i en vev kultur. Enhancer-jeg er sterkt korrelert med genetisk sletting men gir midlertidig deaktivering som er avhengig av histone deacetylases (HDACs). Ved å levere guide RNAs via forbigående transfection i motsetning til stabile integrasjon via viral vektorer, unngår denne protokollen avsettelse og potensielle spredning av H3K9me3. Denne protokollen detaljer guide RNA design og kloning via Gibson montering, hva av guide RNAs med lipofection og analyse av resulterende genuttrykk endringer av qPCR. Vi har også metoder for å vurdere spesifisiteten av Enhancer-i mål for Genova og transcriptome. Mens denne teknikken ble utviklet for å studere genet regulering er bundet enhancers i menneskets kreftcelle linjer, det gjelder Disseksjon av alle pattedyr enhancer.
Denne protokollen beskriver en enkel og fleksibel metode for dissekere enhancer funksjonen på endogene genomisk locus uten fysisk endre DNA sekvensen. Mens lignende i konsept til tidligere publiserte CRISPR forstyrrelser protokollene ved hjelp dCas9-KRAB27, Enhancer-jeg er forskjellig fra disse protokollene i 3 måter. Først bruker Enhancer-jeg SIN3A samspill domenet MAD120 å oppnå enhancer deaktivering. Enhancer deaktivering kan reddes ved hjelp HDAC hemmere, antyder at den primære mekanismen for deaktivering er HDAC avhengige. I motsetning til CRISPR innblanding dCas9-KRAB føre Enhancer-jeg ikke til avleiring av H3K9me3. Dette er sannsynlig skyldes at Enhancer-jeg er avhengig av forbigående innføring av guide RNAs, med celler blir høstet etter 3 dager legge transfection. CRISPR forstyrrelse, er det observert en økning i H3K9me3 på 7 dager innlegget signaltransduksjon12. Til slutt gir Enhancer-i protokollen en strategi for å målrette flere nettsteder samtidig og overvåke effektiviteten av målretting. I mosaikk-seq17, dCas9-KRAB brukes til å målrette flere enhancers samtidig, men denne teknikken er avhengig av én celle RNA sekvensering å identifisere uttrykk endringer, og mange gener (for eksempel østrogen-responsive gener) gå usett på grunn av lav Følsomheten av encellede RNA-seq. Enhancer-jeg gir en pålitelig metode for å studere enhancers individuelt og i kombinasjon for enhver genet.
Det viktigste trinnet i Enhancer-jeg er hva, som skal være optimalisert for den cellen interesse. Denne protokollen er avhengig av puromycin behandling å berike for transfekterte celler, men det er mulig at co transfecting guide RNAs med et fluorescerende protein og sortering for fluorescerende celler ved hjelp av flowcytometri kan vise seg for å være en bedre berikelse for noen celle typer. Vi anbefaler overvåking uttrykk nivå av guide RNAs og SID4x-dCas9-KRAB av qPCR til å feilsøke og bekrefte hva. Hvis guide RNA nivåer er lav (syklus terskelen > 30), brukere kan også vurdere alternative guide RNA produksjon strategier som i vitro transkripsjon28. Det er også mulig at til tross for høy gRNA nivåer, guide RNA målretting av SID4x-dCas9-KRAB protein er ineffektivt, da velge forskjellige guide RNA sekvenser kan være nødvendig. Ved å utføre ChIP-seq på fusion protein med chromatin fra Enhancer-jeg behandlet celler, kan effektiviteten av målretting overvåkes. Hvis høy signal av SID4x-dCas9-KRAB på området av interesse, og uttrykket endringer i sin antatte målet genet oppdages, deretter bidrar regionen trolig ikke til uttrykk for det genet under forhold studert.
En potensiell begrensning av Enhancer-jeg er at off-målet effekter kan samle Hvis for mange nettsteder er målrettet samtidig. Likevel har CRISPR forstyrrelser strategier for knockdown færre av målet effekter enn RNAi29, spesielt når en polyklonale celle linje uttrykke dCas9-KRAB brukes. Mens vi har sett av mål genomisk binding av SID4X-dCas9-KRAB når målretting 10 nettsteder samtidig, har vi ikke funnet gene expression endringer de bindende hendelsene. Noen enhancers kan kontakte flere arrangører og/eller andre enhancers, er det mulig at mange gener kan endre uttrykket på målretting av en enkelt enhancer, men det er uklart om denne typen genreguleringen er vanlig. For å bekrefte at endres uttrykket observert skyldes rettet mot en bestemt enhancer, og ikke av mål effekter, kan brukere utføre Enhancer-i to forskjellige sett med ikke-overlappende guide RNAs rettet mot samme område. I tillegg kan genetisk sletting for ved hjelp nuclease-kompetent Cas9 videre bekrefte dens virkning på genuttrykk.
Som Enhancer-i funksjoner gjennom histone deacetylation, er det mulig at dens deaktivering evner er begrenset til enhancers som har nevneverdig nivåer av histone acetylation. Det finnes en rekke alternative undertrykkende fusjoner som kan være mer effektiv på målretting bestemte enhancers. DNA methyltransferase fusjoner til dCas9 kan brukes til å redusere genuttrykk når rettet mot distale enhancers30, men denne undertrykkelse er ofte ikke forbigående. En annen undertrykkende fusion bruker domenet venn av GATA1 (FOG1), som fører til histone H3 lysin 27 trimethylation og represses genuttrykk på nivåer ligner dCas9-KRAB over en rekke cellen linjer og arrangører31. Interessant, redusert å legge til flere kopier av FOG1 dCas9 undertrykkende potensial på arrangører, antyder at en enkelt kopi av SID domenet kan gi mer enhancer deaktivering enn 4 kopiene som brukes i Enhancer-i. Det er mulig at noen loci kan ha nytte av dobbelt målretting av forskjellige kombinasjoner av de ovennevnte dCas9 fusjoner. For eksempel kan stabil langsiktig undertrykkelse oppnås ved samtidige signaltransduksjon dCas9-DNMT3a og dCas9-KRAB32. De fleste av disse undertrykkende fusjoner har bare vært rettet mot en enkelt locus samtidig, og det er fortsatt uklart som er mest effektiv til å manipulere flere enhancers samtidig.
Enhancer-i, mens en egnet metode for å studere kombinasjoner av enhancers for en håndfull av gener er fortsatt noe begrenset i gjennomstrømming hvis brukeren ønsker å studere mulige enhancers for hundrevis av gener. Fremtidige anvendelser av denne teknikken vil innlemme imaging-baserte teknologier å kvantifisere flere gener i flere prøver samtidig. Viktigere, er disse teknologiene kompatible med direkte deteksjon av RNA molekyler fra lysate, eliminerer behovet for tidkrevende RNA isolasjon. Disse tilpasninger vil lette avhør av større sett av enhancers.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH/NHGRI R00 HG006922 og NIH/NHGRI R01 HG008974 til JG Huntsman Cancer Institute. J.B.C. ble støttet av NIH treningsprogrammet i genetikk T32GM007464.
ZR 96-well Quick-RNA Kit | Zymo Research | R1053 | |
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step | Applied Biosystems | 4389986 | |
AflII restriction enzyme | NEB | R0520S | |
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | NEB | M0531L | |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621L | |
FuGENE HD | Promega | E2312 | |
DNA Clean & Concentrator Kit | Zymo Research | D4013 | |
Buffer RLT Plus | Qiagen | 1053393 | |
b-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | |
Human: Ishikawa cells | ECACC | 99040201 | |
H3K27ac rabbit polyclonal | Active Motif | 39133 | |
H3K9me3 rabbit polyclonal | Abcam | ab8898 | |
FLAG mouse monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
ER alpha rabbit polyclonal | Santa Cruz | sc-544 | |
pGL3-U6-PGK-Puro plasmid | Addgene | 51133 | Shen et al., 2014 |
gRNA_cloningVector plasmid | Addgene | 41824 | Mali et al., 2013 |
AflII U6 puromycin plasmid | Addgene | 106404 | Carleton et al., 2017 |
SID4X-dCas9-KRAB plasmid | Addgene | 106399 | Carleton et al., 2017 |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, with KAPA mRNA Capture Beads | Kapa Biosytems | KK8420 | |
Pierce Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets | ThermoFisher Scientific | A32959 | |
Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 252549-25ML | |
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 10131035 | |
LB Broth | ThermoFisher Scientific | 10855001 | |
Quick-DNA Miniprep Kit | Zymo Research | D3020 | |
Quick-Load Purple 2-Log DNA Ladder | NEB | N0050S |