Kvantitativ analys av alternativa Pre-mRNA Splicing i mus hjärnan sektioner med RNA In Situ hybridisering analys
Summary
En i situ hybridisering (ISH) protokoll som använder kort antisense oligonukleotider för att upptäcka alternativa pre-mRNA skarvning mönster i mus hjärnan avsnitten beskrivs.
Abstract
Alternativ splitsning (AS) förekommer hos mer än 90% av mänskliga gener. Det uttryck pattern av ett alternativt skarvade exon regleras ofta i en cell typspecifika mode. SOM uttryck mönster analyseras vanligen av RT-PCR och RNA-seq använder RNA prover isolerade från en population av celler. In situ granskning av som uttrycksmönster för en viss biologisk struktur kan utföras av RNA i situ hybridisering (ISH) använder exon-specifika prober. Denna särskilda användning av ISH har dock begränsats eftersom alternativa exoner är i allmänhet alltför kort för att designa exon-specifika prober. I denna rapport beskrivs användningen av BaseScope, en nyligen utvecklad teknik som sysselsätter kort antisense oligonukleotider i RNA ISH, att analysera som uttrycksmönster i mus hjärnan sektioner. Exon 23a Neurofibromatos typ 1 (Nf1) används som ett exempel för att illustrera att kort exon-exon junction sonder uppvisar robust hybridisering signaler med hög specificitet i RNA ISH analys på mus hjärnan sektioner. Viktigare, kan signaler detekteras med exon integration – och hoppa-specifika sonder användas på ett tillförlitligt sätt beräkna de procent som skarvas i värden för Nf1 exon 23a expression i olika anatomiska områden i en mus hjärna. Experimentellt protokoll och beräkningsmetoden för som analys presenteras. Resultaten tyder på att BaseScope ger ett kraftfullt nya verktyg för att bedöma som uttryck mönster i situ.
Introduction
Alternativ splitsning (AS) är en gemensam process som uppstår under pre-mRNA mognad. I denna process kan ett exon differentially inkluderas i mogen mRNA. Således, AS, en gen kan generera många mRNA den kod för olika proteinprodukter. Det uppskattas att 92 – 94% av mänskliga gener genomgår alternativ splitsning1,2. Onormal alternativ splitsning mönster resulterade från genetiska mutationer har kopplats till ett stort antal sjukdomar, däribland amyotrofisk lateralskleros, internationellt dystrofi och cancer3,4. Således är det viktigt att utreda och bättre förstå alternativ splitsning regleringsmekanismer för att försöka hitta nya behandlingar av sjukdomar hos människor.
SOM regleras ofta i en cell typspecifika mode. Det är viktigt att bestämma AS uttrycksmönstret av en specifik gen i ett givet biologiska system. Men blir detta komplicerat när en komplexa organ som innehåller många olika typer av celler, såsom hjärnan eller hjärtat, studeras. I det här fallet är ett idealiskt val av analyssystem RNA i situ hybridisering (ISH) använda vävnad avsnitten så AS uttrycksmönstret av en specifik gen kan upptäckas i många celltyper samtidigt. Exon-specifika prober har faktiskt använts för att bedöma uttrycksnivåerna för en alternativ exon5,6,7. Men är detta synsätt inte väl lämpad för som mönstret analys av följande skäl. Första, konventionella ISH metoder brukar använda sonder längre än 300 bp, medan den genomsnittliga storleken på ryggradsdjur inre exonerna (inte första eller sista exon) är 170 nukleotider8,9. Andra när en exon-specifika sonden används för att granska mönstret för skarvning av en inre alternativa exon, är den enda mRNA isoform upptäcks av sonden en som innehåller exon, medan den mRNA isoformen utan exon inte kan upptäckas. Således är beräkning av procent skarvas i (PSI) värde för de alternativa exon komplicerade. Dessutom kombinerar konventionella fluorescerande ISH ofta ISH med immunfärgning, vilket minskar den upptäckt effektivitet och tålighet. Till exempel i en studie som undersökte den stressinducerade skarvning isoform växling av acetylkolinesteras (AChE) mRNA, digoxigenin införlivades i ISH sonden och detekteras med hjälp av anti-digoxigenin antikroppar. Alternativt, biotin-märkt sonden upptäcktes av en alkalisk fosfatas/streptividin konjugat och substrat för alkaliskt fosfatas10. Varken metod använder någon förstärkning strategi för att öka känsligheten för upptäckt. Som ett resultat, det svårt för att identifiera mRNA avskrifter som uttrycks på låga nivåer. Således behövs ett enklare och mer robust ISH assay system att analysera som uttryck mönster i situ.
BaseScope har nyligen utvecklats baserat på plattformen av RNAscope, en väletablerad och utsträckning ISH analyssystem. Både analys system anställa en mål-specifik amplifiering teknik som ökar känsligheten för upptäckt11,12. Vad skiljer en från den andra är längden på sekvensen mål, som är så korta som 50 nukleotider för BaseScope och 300 – 1 000 nukleotider för RNAscope. Det är således möjligt att design sonder som är inriktade på exon-exon vägkorsningar att upptäcka särskilda alternativ mRNA isoformer. I den aktuella studien inrättades ett förfarande för att undersöka som uttrycksmönster av Neurofibromatos typ 1 (Nf1) exon 23a, en alternativ exon flitigt studerade i samma laboratorium13,14,15 , 16 , 17, i mus hjärnan sektioner. Resultaten visar att BaseScope är ett idealiskt system att studera uttrycksmönster av Nf1 exon 23a i situ. Eftersom detta test system kan anpassas till analysera som uttrycksmönster för många alternativa exoner, utgör det ett kraftfullt nya verktyg i studierna av AS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta meddelande rapporterar användning av BaseScope RNA ISH att undersöka som uttrycksmönster i mus hjärnan sektioner. Det har påvisats att anti känsla exon-exon junction sonder kortare än 50 nukleotider kan rikta exon integration och hopanden isoformer kraftfullt och specifikt. De resulterande signalerna kan dessutom användas för att beräkna PSI av en alternativ exon.
Några varianter testades i förfarandet. Exempelvis fryst vävnadssnitt genereras av kryostaten snittning testades…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av American Heart Association [bidrag 0365274B till H.L.], National Cancer Institute [GI SPORE P50CA150964 till Z.W.], National Institutes of Health [Office av forskning infrastruktur delas Instrumentation Grant S10RR031845 till den ljusmikroskopi Imaging anläggning vid Case Western Reserve University], och Kina stipendium rådet [X.G.].
Författarna tackar Richard Lee i ljus Microscopy Imaging kärnan för hans hjälp med diabilder.
Materials
| Equipment | |||
| Hybridization Oven | Advanced Cell Diagnostics | 241000ACD | |
| Humidity Control Tray (with lid) | Advanced Cell Diagnostics | 310012 | |
| Stain Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310017 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | 1160049SH | |
| Imperial III General Purpose Incubator | Lab-Line | 302 | |
| Slide Scanner | Leica | SCN400 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pretreatment kit | Advanced Cell Diagnostics | 322381 | |
| Hydrogen Peroxide | Advanced Cell Diagnostics | 2000899 | |
| Protease III* | Advanced Cell Diagnostics | 2000901 | |
| 10X Target Retrieval | Advanced Cell Diagnostics | 2002555 | |
| BaseScope Detection Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 332910 | |
| AMP 0 | Advanced Cell Diagnostics | 2001814 | |
| AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 2001815 | |
| AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 2001816 | |
| AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 2001817 | |
| AMP 4 | Advanced Cell Diagnostics | 16229B | |
| AMP 5-RED | Advanced Cell Diagnostics | 16229C | |
| AMP 6-RED | Advanced Cell Diagnostics | 2001820 | |
| Fast RED-A | Advanced Cell Diagnostics | 2001821 | |
| Fast RED-B | Advanced Cell Diagnostics | 16230F | |
| 50X Wash Buffer | Advanced Cell Diagnostics | 310091 | |
| Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701021 | |
| Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701081 | |
| Control slide-mouse 3T3 cell pellet | Advanced Cell Diagnostics | 310045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other supplies | |||
| Humidifying Paper | Advanced Cell Diagnostics | 310015 | |
| Washing Rack | American Master Tech Scientific | 9837976 | |
| Washing Dishes | American Master Tech Scientific | LWS20WH | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| Glass Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass, 24 x 50 mm | Fisher Scientific | 12–545-F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | 002689 | |
| 100% ethanol (EtOH) | Decon Labs | 2805 | |
| formalde solution | Fisher Scientific | SF94-4 | |
| Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | 17012359 | |
| Mounting Medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 173942 |
References
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).
- Cieply, B., Carstens, R. P. Functional roles of alternative splicing factors in human disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).
- Xiong, H. Y., et al. RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease. Science. 347, 1254806 (2015).
- Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. Novel splice variants in the 5’UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5’UTRs and differential expression in the neuronal dendrites. Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).
- Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain. BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).
- Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing?. Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).
- Cassidy, A., Jones, J. Developments in in situ hybridisation. Methods. 70, 39-45 (2014).
- Meshorer, E., et al. Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity. Science. 295, 508-512 (2002).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).
- Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons. Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).
- Nguyen, H. T., et al. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice. Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).
- Zhou, H. L., et al. Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).
- Sharma, A., et al. Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).
- Adzemovic, M. Z., et al. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
- Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , (2017).
