Oncogene 유도 노화 중 반응성 산소 종 및 정상적인 인간 섬유 아 세포에서 분 비 형 노화 관련의 정량적 측정
Summary
세포내 선생님 세포 노화의 유도에 중요 한 역할을 보여줘 왔다. 여기, 우리는 세포 노화 중 선생님 수준 측정을 위한 중요 한 분석 결과 설명 합니다. 우리는 또한 노화 관련 분 비 표현 형, 다양 한 연령과 관련 된 장애에 기여 하는 보도 평가 하기 위한 프로토콜을 제공 합니다.
Abstract
세포 노화 증식 능력 또는 다양 한 스트레스에 노출의 고갈에 따라 돌이킬 수 없는 성장 검거의 상태를 고려 하고있다. 최근 연구 개발, 상처 치유, 면역 감시 및 연령 관련 조직 장애를 포함 하 여 다양 한 생리 적 프로세스를 세포 노화의 역할을 확대 했습니다. 세포 주기 검거 세포 노화의 중요 한 특징은, 증가 된 세포내 반응 산소 종 (선생님) 생산 또한 세포 노화의 유도에 중요 한 역할을 증명 되었습니다. 또한, 최근 연구는 노화 세포 인접 세포와 노화 관련 분 비 형 (SASP)를 통해 조직에 강력한 paracrine 활동 전시 밝혔다. 세포 노화에 대 한 치료 전략에 대 한 관심이 급상승 노화 메커니즘, 세포내 선생님 등은 SASP의 정확한 이해를 위한 필요를 강조 한다. 여기, 우리는 양적 h 조-Ras-유도 세포 노화 선생님-민감한 형광 염료와 cytometry 사용 하 여 동안 세포내 선생님 레벨을 평가 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 또한, mRNA 식의 유도 및 SASP 요인의 분 비의 분석을 위한 중요 한 기술을 소개합니다. 이러한 프로토콜은 다양 한 세포 노화 모델에 적용할 수 있습니다.
Introduction
50 년 이상 전, Hayflick와 무어 헤드 정상 세포 세포 분열1의 특정 번호 후 그들의 증식 잠재력의 고갈에 돌이킬 수 없는 성장 검거 입력 밝혔다. 이 현상은 이제 일차 노화 라고 고 organismal 노화2와 강하게 상관 하기 위하여 믿어진다. Telomeres의 점진적 침식 일차 노화의 주요 원인으로 간주 됩니다, 하지만 DNA 손상, 종양 활성화 및 산화 스트레스 등 다양 한 세포 스트레스 보고 되었습니다 다른 유형의 세포 노화를 유도 “조기 노화” 또는 “-스트레스로 노화” 라고합니다. 흥미롭게도, 조기 노화는 h 조-Ras와 BRAF oncogenes의 활성화에 따라 강력한 종양 진압 역할을 한다. 조직과 인간의 마우스 모델의 연구 생산 biomarkers 세포 노화의 종양 Ras와 BRAF 활성화 하지만에서 개발한 악성 암에 점감 되었다 premalignant 병 변에서 주로 존재 했다 강력한 증거 이러한 병 변3,,45. 노화 및 종양 억제의 역할을 넘어 세포 노화 상처 치유, 조직 복구, 면역 감시, 그리고 배아 개발6을 포함 하 여 다양 한 생리 적 과정에 역할을 이전 연구에 표시 되었습니다.
성장 검거 세포 노화7의 특징으로 광범위 하 게 공부 하고있다, 비록 증거의 중요 한 신체는 세포 반응성 산소 종 (선생님)도 세포 노화8에 기여 나왔다. 세포 노화, 일차 노화 및 노화 (OIS), oncogene 유도 포함 하 여 다양 한 유형의 동안 선생님 수준 상승 수십 년 전 원래 알려졌다9,10. 더 직접, H2O2 의 sublethal 복용량 exogenous 치료 노화11,12유도합니다. SOD1, 같은 선생님 청소 효소의 금지는 또한 조기 노화13발생합니다. 반면, 주변 산소 조건 낮은 선생님 청소 지연 노화10,,1415의 발병을 증가 하 고. 이러한 결과 의심할 여 지 없이 선생님은 중요 한 중재자 또는 세포 노화 유도의 결정 요인 다는 것을 나타냅니다. 그러나, 선생님 세포 노화와 세포 노화 중 선생님 레벨은 상승 하는 어떻게의 유도에 기여 하는 방법 조사 더 필요 합니다.
최근 연구는 노화 세포는 인접 세포와 SASP16,17를 통해 조직에 강력한 paracrine 활동 계시 했다. 세 조직에 노화 세포를 증식 세포의 자치 고갈 뿐만 아니라 SASP 통해 많은 경로 연령 관련 조직 장애를 통해 홍보. 다양 한 proinflammatory 요인, 일리노이-6와 같은 일리노이-8, TGFβ, 그리고 매트릭스 metalloproteinases (MMPs), 노화 세포에 의해 분 비 원인이 조직의 항상성, 조직 구조의 파괴의 장애를 통해 나이 관련 조직 장애 인접 셀과 살 균 염증18,19의 노화. 그러나, SASPs는 생물학 컨텍스트에 따라 유익한 효과 가질 수 있습니다. 또한, SASPs의 heterogenetic 자연 노화 세포 유형과 더 연구19에 대 한 필요성을 강조 셀 단계에 따라 달라 집니다.
여기, OIS 동안 세포내 ROS 수준을 평가 하기 위한, 빠르고 민감한 cytometry 기반 기술을 설명 합니다. 또한, 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)와 ELISA를 사용 하 여 SASP 요인의 분석에 대 한 방법은 소개 했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리는 WI-38 정상적인 인간의 섬유 아 세포에서 h 조-Ras-유도 노화 동안 세포내 선생님 레벨을 모니터링 하기 위한 방법을 제시. 라이브 세포에서 세포내 선생님 수준 양적 세포 투과 시 DCF 다를 사용 하 여 측정 될 수 있다과 cytometry 합니다. 세포질 통풍 관에 DCF 다 세포내 esterases에 의해 deacetylated 이며, 형성 높은 형광 2′, dichlorofluorescein (DCF)-7′ 선생님에 의해 연속적으로, 산화. DCF 형광 cytometry…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품 (김 영 연)를 국가 연구 한국 재단 (2015R1D1A1A01060839)에서 교부 금에 의해 그리고 (MSIT) 한국 정부에 의해 자금 한국 국가 연구 재단 (NRF) 교부 금에 의해 지원 되었다 (번호 2016R1A2B2008887 호 2016R1A5A2007009) (Jeanho 윤)에.
Materials
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| BOSC 23 | ATCC | CRL-11269 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| pBabe puro-H-RasV12 | Addgene | 1768 | |
| pGAG/pol | Addgene | 14887 | |
| pVSVG | Addgene | 1733 | |
| Turbofect | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| DCF-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | 10 mM |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| MMLV Reverse transcriptase | Promega | M1701 | |
| SYBR Green PCR master 2X mix | Takara | PR820A | |
| Random Primer | Promega | C118A | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Human IL-6 ELISA assay | PeproTech | #900-TM16 | |
| Human IL-8 ELISA assay | PeproTech | #900_TM18 | |
| EQUIPMENTS | |||
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| Parafilm | BEMIS | PM-996 | |
| Microscope | NIKON | TS100 | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | LSR Fortessa | |
| Amicon Ultra-4ml | Merk Millipore | UFC800324 | |
| NanoDrop spectrophotometer | BioDrop | 80-3006-61 | |
| Real-time PCR System | Applied Biosystems | ABI Prism 7500 | |
| ELISA Reader | Molecular Devices | EMax microplate reader |
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