Oncogene 유도 노화 중 반응성 산소 종 및 정상적인 인간 섬유 아 세포에서 분 비 형 노화 관련의 정량적 측정

Summary

세포내 선생님 세포 노화의 유도에 중요 한 역할을 보여줘 왔다. 여기, 우리는 세포 노화 중 선생님 수준 측정을 위한 중요 한 분석 결과 설명 합니다. 우리는 또한 노화 관련 분 비 표현 형, 다양 한 연령과 관련 된 장애에 기여 하는 보도 평가 하기 위한 프로토콜을 제공 합니다.

Abstract

세포 노화 증식 능력 또는 다양 한 스트레스에 노출의 고갈에 따라 돌이킬 수 없는 성장 검거의 상태를 고려 하고있다. 최근 연구 개발, 상처 치유, 면역 감시 및 연령 관련 조직 장애를 포함 하 여 다양 한 생리 적 프로세스를 세포 노화의 역할을 확대 했습니다. 세포 주기 검거 세포 노화의 중요 한 특징은, 증가 된 세포내 반응 산소 종 (선생님) 생산 또한 세포 노화의 유도에 중요 한 역할을 증명 되었습니다. 또한, 최근 연구는 노화 세포 인접 세포와 노화 관련 분 비 형 (SASP)를 통해 조직에 강력한 paracrine 활동 전시 밝혔다. 세포 노화에 대 한 치료 전략에 대 한 관심이 급상승 노화 메커니즘, 세포내 선생님 등은 SASP의 정확한 이해를 위한 필요를 강조 한다. 여기, 우리는 양적 h 조-Ras-유도 세포 노화 선생님-민감한 형광 염료와 cytometry 사용 하 여 동안 세포내 선생님 레벨을 평가 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 또한, mRNA 식의 유도 및 SASP 요인의 분 비의 분석을 위한 중요 한 기술을 소개합니다. 이러한 프로토콜은 다양 한 세포 노화 모델에 적용할 수 있습니다.

Introduction

50 년 이상 전, Hayflick와 무어 헤드 정상 세포 세포 분열¹의 특정 번호 후 그들의 증식 잠재력의 고갈에 돌이킬 수 없는 성장 검거 입력 밝혔다. 이 현상은 이제 일차 노화 라고 고 organismal 노화²와 강하게 상관 하기 위하여 믿어진다. Telomeres의 점진적 침식 일차 노화의 주요 원인으로 간주 됩니다, 하지만 DNA 손상, 종양 활성화 및 산화 스트레스 등 다양 한 세포 스트레스 보고 되었습니다 다른 유형의 세포 노화를 유도 "조기 노화" 또는 "-스트레스로 노화" 라고합니다. 흥미롭게도, 조기 노화는 h 조-Ras와 BRAF oncogenes의 활성화에 따라 강력한 종양 진압 역할을 한다. 조직과 인간의 마우스 모델의 연구 생산 biomarkers 세포 노화의 종양 Ras와 BRAF 활성화 하지만에서 개발한 악성 암에 점감 되었다 premalignant 병 변에서 주로 존재 했다 강력한 증거 이러한 병 변^3,,45. 노화 및 종양 억제의 역할을 넘어 세포 노화 상처 치유, 조직 복구, 면역 감시, 그리고 배아 개발....

Protocol

1. 노 쇠를 Oncogene 유도 유도

1. 준비는 H-RasV12 레트로 바이러스
   1. 실 온에서 0.001% 폴 리-L-리 신/인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 5 분의 2 개 mL를 추가 하 여 100 mm 문화 접시 코트.
   2. 진공에 연결 하는 유리 피 펫을 사용 하 여 폴 리-L-리 신 솔루션을 제거 하 고 1 x PBS의 2 개 mL를 추가 하 여 문화 접시를 세척.
   3. 접시 3 x 10⁶ ecotropic BOSC 23 포장 코팅 문화 접시와 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 1% 페니실린/스, 전지와 CO₂ 조직 문화에서 37 ° C에서 문화 1 d 인큐베이터입니다.
   4. 다음 날, transfect retroviral 포장 DNA (pGAG/폴의 2 µ g과 pVSVG의 0.25 µ g) 함께 pBabe 순수 하지 않아-H-RasV12 DNA의 2 µ g transfection 시 약을 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 8 h에 대 한.
   5. Transfection 미디어를 제거 하 고 신선한 미디어의 8 mL를 추가 합니다.
   6. 48 h 후 바....

Results

H 조-Ras-유도 노화의 예는 그림 1에 표시 됩니다. WI-38 정상적인 인간의 섬유 아 세포와 H-RasV12 레트로 바이러스의 감염 유도 극적인 형태 변화 (그림 1B). 또한, 그림 1C에서 같이, SA β-gal 얼룩 활동 H RasV12 식에 따라 현저 하 게 증가 되었다. 셀의 70% 이상 보여준 SA β-gal 활동 6 d H RasV12 레트로 바이러스 감염 후 얼룩, 우리와 다른 그룹 보고 이전^{21 H-RasV12의 식을 성공적으로 WI-38 세포, 세포 노화 유도 나타내는 22}.

Discussion

여기, 우리는 WI-38 정상적인 인간의 섬유 아 세포에서 h 조-Ras-유도 노화 동안 세포내 선생님 레벨을 모니터링 하기 위한 방법을 제시. 라이브 세포에서 세포내 선생님 수준 양적 세포 투과 시 DCF 다를 사용 하 여 측정 될 수 있다과 cytometry 합니다. 세포질 통풍 관에 DCF 다 세포내 esterases에 의해 deacetylated 이며, 형성 높은 형광 2', dichlorofluorescein (DCF)-7' 선생님에 의해 연속적으로, 산화. DCF 형광 cytometry FL1 검출기 (그린 형광)를 사용 하 여 검색할 수 있습니다. DCF 다 얼룩 방법을 사용 하 여, 우리가 성공적으로 증가 선생님 수준에서 동안 검색 WI-38 정상적인 인간의 섬유 아 세포에서 h 조-Ras-유도 세포 노화. 이 메서드는 선생님 수준에서 변경 사항을 모니터링 하 세포 노화의 다양 한 모델에 사용할 수 있습니다. DCF-다 함께 선생님 유도 측정 하는 데 사용 된 얼룩, 추가 방법 산화 단백질

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약-
L-lysine	Sigma-Aldrich	P2636
BOSC 23	ATCC	CRL-11269
FBS	GIBCO	16000-044
페니실린/스트렙토마이신	웰진	LS202-02
PBS	Hyclone	SH30013.02
DMEM	GIBCO	12800-082
OPTI-MEM	GIBCO	31985-070
pBabe puro-H-RasV12	Addgene	1768
pGAG/pol	Addgene	14887
pVSVG	Addgene	1733
Turbofect	Thermo Fisher Scientific	R0531
폴리브레렌	Sigma-Aldrich	H9268	8 mg/mL
puromycin	Sigma-Aldrich	P8833	2 mg/mL
포름 알데히드	: 시그마 -알드리치	F8775
5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌릴 &베타; D-갈락토피라노시드 (X-gal)	Sigma-Aldrich	B4252
페로시아나이드 칼	Sigma-Aldrich	B4252
페리시아나이드 칼	Sigma-Aldrich	P9387
트립신-EDTA	웰진	LS015-01
DCF-DA	Sigma-Aldrich	D6883	10 mM
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026
MMLV 역전사효소	Promega	M1701
SYBR Green PCR 마스터 2x 믹스	Takara	PR820A
랜덤 프라이머	Promega	C118A
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
초순수 증류수	Invitrogen	10977015
인간 IL-6 ELISA 분석	PeproTech	#900-TM16
인간 IL-8 ELISA 분석	PeproTech	#900_TM18
EQUIPMENTS
0.45 μ m 주사기 필터	사토리우스	16555
파라필름	BEMIS	PM-996
현미경	니콘	TS100
유세포 분석기	BD Bioscience	LSR Fortessa
Amicon Ultra-4ml	Merk Millipore	UFC800324
NanoDrop 분광 광도계	BioDrop	80-3006-61
실시간 PCR 시스템	응용 Biosystems	ABI 프리즘 7500
ELISA 리더	Molecular Devices	EMax 마이크로플레이트 리더