Intracellulära ROS har visat sig spela en viktig roll i induktion av cellulära åldras. Här beskriver vi en känslig analys för att kvantifiera ROS nivåer under cellulära åldras. Vi tillhandahåller även protokoll för att bedöma den åldras-associerade sekretoriska fenotyp, som enligt uppgift bidrar till olika åldersrelaterade dysfunktioner.
Cellulära åldras har ansetts vara ett tillstånd av irreversibel tillväxt gripandet vid konsumtion av proliferativ kapacitet eller exponering för olika påfrestningar. Nyligen genomförda studier har utökat rollen av cellulära åldras olika fysiologiska processer, inklusive utveckling, sårläkning, immun övervakning och åldersrelaterade vävnad dysfunktion. Även om cellcykelarrest är ett avgörande kännetecken för cellulära åldras, har en ökad intracellulär reaktivt syre arter (ROS) produktion också visats spela en viktig roll i induktion av cellulära åldras. Senare studier visade dessutom att senescent celler uppvisar potent parakrin aktiviteter på angränsande celler och vävnader genom en åldras-associerade sekretoriska fenotyp (SASP). Den kraftiga ökningen intresse angående terapeutiska strategier mot cellulära åldras betonar behovet av en exakt förståelse åldras mekanismer, inklusive intracellulära ROS och SASP. Här beskriver vi protokoll för att kvantitativt bedöma intracellulära ROS nivåer under H-Ras-inducerad cellulära åldras med ROS-känsliga fluorescerande färgämne och flödescytometri. Dessutom introducerar vi känsliga tekniker för analys av induktion av mRNA uttryck och utsöndring av SASP faktorer. Dessa protokoll kan tillämpas på olika cellulära åldras modeller.
Mer än 50 år sedan visade att normala celler in irreversibel tillväxt gripandet vid konsumtion av deras proliferativ potential efter ett visst antal celldelningar1Hayflick och Moorhead. Detta fenomen kallas nu replikationsförmåga åldras och tros starkt korrelerar med organismers åldrande2. Även om en gradvis urholkning av telomerer anses vara en viktig orsak till replikationsförmåga åldras, har olika cellulära påfrestningar, som DNA skador, onkogena aktivering och oxidativ stress, rapporterats inducera en annan typ av cellulära åldras kallas ”förtida åldrande” eller ”stressinducerade åldras”. Intressant, spelar för tidigt åldrande en potent tumör-suppressiv roll vid aktivering av onkogener som H-Ras och BRAF. Studier av musmodeller och mänskliga vävnader har producerat starka bevis som biomarkörer för cellen åldras fanns huvudsakligen i premaligna lesioner där onkogena Ras och BRAF aktiveras men minskades i elakartade cancerformer som utvecklats från dessa lesioner3,4,5. Utöver sin roll i åldrande och tumör dämpning, har cellulära åldras visats i tidigare studier att spela en roll i olika fysiologiska processer, inklusive sårläkning, vävnad reparera, immun övervakning och embryonal utveckling6.
Även om tillväxt gripandet har studerats som ett kännetecken för cellulära åldras7, tyder en betydande mängd bevis det intracellulära reaktiva syreradikaler (ROS) bidrar också till cellulära åldras8. Höjden av ROS nivåer under olika typer av cellulära åldras, inklusive replikationsförmåga åldras och onkogen-inducerad åldras (OIS), rapporterades ursprungligen decennier sedan9,10. En mer direkt, exogena behandling med en subletala dos av H2O2 inducerar åldras11,12. Hämning av ROS-rensning enzymer, såsom SOD1, orsakar också tidig åldras13. Däremot låg omgivande Syreförhållandena och öka ROS rensning försening uppkomsten av åldras10,14,15. Resultaten visar utan tvekan att ROS är viktiga medlare eller bestämningsfaktorerna för cellulära åldras induktion. Men hur ROS bidrar till induktion av cellulära åldras och hur ROS-nivåerna är förhöjda under cellulärt åldrande kräver ytterligare utredning.
Senare studier visat att senescent celler har potent parakrin aktiviteter på angränsande celler och vävnader genom en SASP16,17. I år vävnad främja senescent celler åldersrelaterade vävnad dysfunktioner via många vägar genom SASP förutom en autonom uttömning av proliferativ celler. Olika proinflammatoriska faktorer, till exempel IL-6, IL-8, TGFβ och matrix metalloproteinaser (MMP), utsöndras av senescent celler, orsaka åldersrelaterade vävnad dysfunktioner genom nedskrivning av vävnad homeostas, förstörelse av vävnad arkitektur, åldras av närliggande celler och steril inflammation18,19. Dock kan SASPs ha gynnsamma effekter beroende på de biologiska sammanhanget. Dessutom beror heterogenetic arten av SASPs på den senescent celltypen och cellen scenen, betonar behovet av ytterligare forskning19.
Här beskriver vi snabba och känsliga flödescytometri-baserad teknik för att bedöma intracellulära ROS nivåer under OIS. Dessutom introduceras metoder för analys av SASP faktorer med hjälp av kvantitativ realtids polymeras-kedjereaktion (qPCR) och ELISA.
Här har vi presenterat metoder för att övervaka intracellulära ROS nivåer under H-Ras-inducerad åldras i WI-38 normala mänskliga fibroblaster. Intracellulära ROS nivåer i levande celler kan mätas kvantitativt med hjälp av cell-permeable reagensen DCF-DA och flödescytometri. På cellernas upptag, DCF-DA deacetylated av intracellulära esteraser och därefter oxideras av ROS bildar starkt fluorescerande 2′, 7′-dichlorofluorescein (DCF). DCF fluorescens kan upptäckas av flödescytometri med en FL1 detektor (gr?…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete var stöds av ett bidrag från den National Research Foundation of Korea (2015R1D1A1A01060839) (till ung Yeon Kim) och National Research Foundation i Korea (NRF) bidrag finansieras av Korea regeringen (MSIT) (nr 2016R1A2B2008887, Nr. 2016R1A5A2007009) (till Jeanho Yun).
REAGENTS | |||
poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
BOSC 23 | ATCC | CRL-11269 | |
FBS | GIBCO | 16000-044 | |
penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
pBabe puro-H-RasV12 | Addgene | 1768 | |
pGAG/pol | Addgene | 14887 | |
pVSVG | Addgene | 1733 | |
Turbofect | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma-Aldrich | B4252 | |
potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | B4252 | |
potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
DCF-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | 10 mM |
Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
MMLV Reverse transcriptase | Promega | M1701 | |
SYBR Green PCR master 2X mix | Takara | PR820A | |
Random Primer | Promega | C118A | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
Human IL-6 ELISA assay | PeproTech | #900-TM16 | |
Human IL-8 ELISA assay | PeproTech | #900_TM18 | |
EQUIPMENTS | |||
0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
Parafilm | BEMIS | PM-996 | |
Microscope | NIKON | TS100 | |
Flow cytometer | BD Bioscience | LSR Fortessa | |
Amicon Ultra-4ml | Merk Millipore | UFC800324 | |
NanoDrop spectrophotometer | BioDrop | 80-3006-61 | |
Real-time PCR System | Applied Biosystems | ABI Prism 7500 | |
ELISA Reader | Molecular Devices | EMax microplate reader |