3 차원 (3D)-배열 하는 높은 처리량 Zebrafish 태아에 대 한 서식 파일을 인쇄

요약

여기, 우리 디자인 하 고 서식 파일, 높은 처리량 zebrafish 태아 96 잘 접시에 배열에 대 한 같은 서식 파일의 사용에 자세한 절차 뒤 개 zebrafish 태아 조작 프로토콜을 제시.

초록

제 브라는 세계적으로 인정된 민물 유기 체 자주 사용 개발 생물학, 환경 독성, 그리고 인간의 질병에 관련된 연구 분야 이다. 큰 통치, 배아 반투명, 빠르고 동시 개발, 등, 등의 독특한 기능 zebrafish 태아는 종종 대규모 화학 물질의 독성 평가 및 사용 약물/화합물 심사. 일반적인 심사 절차 포함 성인 zebrafish 산란, 배아 선택, 다 잘 판에 배아를 개. 거기에서 태아 노출 및 화학 물질, 독성을 복종 된다 또는 마약/화합물의 효과 phenotypic 관측에 따라 상대적으로 신속 하 게 평가할 수 있습니다. 이러한 프로세스 중 개 배아 처리량 수준을 제한 하는 가장 시간이 많이 걸리는 하 고 노동 집약적인 단계 중 하나입니다. 이 프로토콜에서 선물이 3D 인쇄 arraying 서식 파일의 사용과 결합 하 게 진공 속도이 힘 드는 단계를 조작 하는 혁신적인 접근 방식. 본 프로토콜 arraying 템플릿, 상세한 실험 설정 및 대표 결과 다음 단계별 절차의 전반적인 디자인을 설명 합니다. 구현 될 때,이 방법은 테스트 과목으로 zebrafish 태아를 사용 하 여 연구 응용 프로그램의 다양 한에서 도움이 증명 해야 합니다.

서론

인기 모델 생물으로 zebrafish 의학 및 독극물^1,2,,34의 분야에서 널리 사용 됩니다. 생체 외에서 플랫폼에 비해, zebrafish 제공 훨씬 더 큰 생물 복잡 하나 또는 2 개의 세포 유형 제공 하지 못했습니다. 모델, zebrafish의 큰 통치, 빠르고 동시 배아 개발 및 높은 기관 전체 유기 체 외 반투명 대규모 독성 또는 약/화합물⁵를 심사에 사용 될이 모델 독특한 이점을 주었다. 매주 성인 zebrafish의 한 쌍에 의해 생성 하는 배아의 수백 다른 모든 동물 모델을 능가 하 고 높은 처리량 검열을 위해 적당 한 만든.

제 브라를 사용 하 여 일반적인 심사 절차 많은 성인 zebrafish 산란, 태아 선택, 그리고 그들이 물 침수를 통해 노출 대상이 되 적당 한 용기에 배아를 개 같은 수동 작업이 포함 됩니다. 태아의 개발은 모니터링 및 사망률, hatchability 등 비정상적인 관찰 끝점 자주 수동으로 평가 화학 물질의 독성 또....

프로토콜

1. 디자인 및 템플릿 개 Zebrafish 태아의 제조

1. 8에서 12, 96-잘 레이아웃을 표준 96 잘 접시를 맞는 arraying 서식 파일을 디자인 합니다. 크기는 위 태아 함정 챔버에 대 한 그림 1A 에 나열 된 사용 (보조 파일 참조).
   1. 함정에 대 한 잘 그림 1B 및 1 D 에 표시 된 크기를 사용 합니다.
   2. 그림 1C 의 크기를 사용 하 여 바닥 진공 챔버에 대 한.
   3. 그림 1B 에서 치수를 사용 하 여에 어에 대 한 / 콘센트.
2. (0.1 m m 정밀도)로 3D 프린터를 사용 하 여 인쇄 서식 파일; 인쇄에 사용할 권장된 수 지에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
   참고: 0.1 m m 정밀 3D 프린터 arraying 서식 파일의 제작에 대 한 권장 ( 재료의 표참조). 서식 파일의 표면에 대 한 제안 된 색상은 어두운 회....

결과

그림 3 은 전형적인 3D 인쇄 arraying 템플릿을 보여준다. 이 감광 성 수 지 원료로 사용 하 여 템플릿과 3D 프린터;에 의해 만들어진 블랙 페인트의 레이어 배아의 색상에 더 나은 대조를 제공 하기 위해 적용 되었습니다. 96 웰 스 (8으로 12)의 위치는 표준 96 잘 접시와 맞게 설계 되었다. 마찬가지로, 384 (16 24) 잘 서식 파일 또한 디자인 될 수 하 고 동일한 방법을 사용 하 여 조작 합니다. 거꾸로 챔버는 더 나은 적합을 제공 하기 위해 표준 96 잘 접시 보다 약간 더 큰. 홈 또한 배열 하는 동안 여분의 배아를 개최 하도록 설계 되었습니다.

겸손 한 속도로 20 접시만 2 ~ 3 접시 수동으로 준비 될 수 있는 하는 동안 30 분 이내 3D 인쇄 arraying 서식 파일을 .......

토론

3D 인쇄 템플릿 개 zebrafish 태아의 성공적인 구현에 대 한 세심 한 관심을 필요로 하는이 프로토콜에서 두 가지 중요 한 단계가 있습니다.

Arraying 서식 파일의 디자인에서 가장 중요 한 요소는 함정을 잘 이다. 확실 하 게 하는 단 하나의 배아 각 우물에 갇혀, 하나 지름과 함정 우물의 깊이 통해 구멍의 지름에 세심 한 관심을 기울여야 한다. 권장된 직경 내에서 (를 포함 하 여는 chorion) 전형적인 태아의 직경의 1.5 ~ 2 배입니다. 잘 함정의 깊이 이어야 한다 내 2 시간 (를 포함 하 여는 chorion) 전형적인 태아의 직경의 같은 우물에서 배아의 스태킹 피하기 위해. 통해 구멍의 지름을 이어야 한다 약 (를 포함 하 여는 chorion) 전형적인 태아의 직경의 절반을 배아는 구멍을 통해 부정적인 압력에 의해 압력을 받고 피하기 위해. 디자인의 복잡성 때문에 3D 인쇄 기술은 arraying 서식 파일의 제작에 대 한는 것이 좋습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
얼룩말 시설	Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.	Z-A-S5
짝지어주는 상자	상해 Haisheng Biotech Co., 주식 회사.
세척 병, 500 ml	Sangon Biotech	F505001-0001
염화나트륨	Vetec	V900058-500G
염화 칼륨	시약 Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd	10016318
염화	칼슘 Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd	20011160
중탄산 나트륨	Vetec	v900182-500G
메틸렌 블루 수화물	TCI	M0501
염산	Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd	10011008
바다 소금	인스턴트 오션	SS15-10
Pipetter	Fisherbrand	13-675M
제어 드롭 파스퇴르 Pipet	Fisherbrand	13-678-30
현미경	OLYMPUS	SZ61
생화학 인큐베이터	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.	LRH-250
3D 프린터	UnionTech	Lite600
감광성 수지	UnionTech	UTR9000
진공 펌프	Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd.	SHB-IIIA
접착제 PCR 플레이트 씰	Solarbio	YA0245
96 웰 플레이트	Costar	3599
멀티 8 채널 피펫 30-300 μ l	Eppendorf	3122000.051
압축 가스 살포기	Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd.	ST1005
DI 물	Thermo	GenPure Pro UV/UF
건조 오븐	상하이 Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.	BPG-9106A
시설 내 물 시스템 물			s 워터 시스템
계란 물			희석 60mg " 인스턴트 오션" 바다 소금 및 0.25 mg/L 메틸렌 블루 1 L DI 물
Holtfreter' s 용액			7.0g 염화나트륨 (NaCl), 0.4g 중탄산 나트륨 (NaHCO3< / sub>), 0.1g 염화칼륨 (KCl), 0.235g 염화칼슘 (CaCl2.2H2O)를 1.9L DI 물에 용해시킵니다. HCl을 사용하여 pH를 7로 조정하고 Di water를 사용하여 부피를 2L로 조정합니다

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