Correspondance de contraste de détergent dans les expériences de diffusion de neutrons de petits angles pour l’analyse structurale de protéines membranaires et la modélisation de Ab Initio

Summary

Ce protocole montre comment obtenir un modèle basse résolution ab initio et des détails de structure d’une protéine de membrane solubilisée détergent en solution par la diffusion des neutrons de petits angles avec filtrage de contraste du détergent.

Abstract

L’instrument de diffusion de neutrons de petits angles biologique au haut Flux Isotope réacteur du Oak Ridge National Laboratory est dédié à l’étude des biomatériaux, biocarburants de traitement et les matériaux bio-inspirés couvrant nanomètre à échelles de micromètre de longueur. Les méthodes présentées ici pour étudier les propriétés physiques (p. ex., la taille et la forme) des protéines membranaires (ici, MmIAP, une protéase d’aspartyl intramembranaires de Methanoculleus marisnigri) dans les solutions micellaires formant des détergents sont bien adapté pour cet instrument de diffusion de neutrons de petits angles, entre autres. Autres techniques de caractérisation biophysique sont gênées par leur incapacité à régler les contributions de détergent dans une structure complexe de protéine-détergent. En outre, l’accès au laboratoire Bio-deutération fournit des capacités uniques pour la préparation des cultures à grande échelle et exprimant des protéines marquées du deutérium pour le signal de diffusion accrue de la protéine. Tandis que cette technique ne fournit pas de détails structuraux à haute résolution, ce manque de connaissances structurale des protéines membranaires contient plusieurs zones adressables de recherche sans nécessiter de résolution atomique près. Par exemple, ces domaines incluent la détermination des États oligomériques, formation d’un complexe, des changements conformationnels durant la perturbation et les événements de pliage/dépliage. Ces enquêtes peuvent être facilement exécutées via des applications de cette méthode.

Introduction

Les protéines membranaires sont codées par environ 30 % de tous les gènes¹ et représentent une forte majorité des cibles pour des médicaments modernes. ² ces protéines effectuent un large éventail de fonctions cellulaires vitales,³ mais en dépit de leur abondance et leur importance, ne représentent qu’environ 1 % du totales structures déposées dans le Research Collaboratory Structural Bioinformatics (RCSB) protéine Banque de données. ⁴ en raison de leur caractère hydrophobe partiellement, détermination structurale des protéines membranaires a été extrêmement difficile. ^{5 , 6 , 7}

Comme beaucoup de techniques biophysiques nécessite monodispersés particules en solution pour la mesure, isoler des protéines de la membrane des membranes natives et la stabilisation de ces protéines dans un imitateur soluble des membranes natives a été un sujet de recherche active au cours des dernières décennies. ^{8 , 9 , 10} ces investigations ont conduit au développement de nombreuses nouvelles amphiphiles assemblées de solubiliser les protéines membranaires, comme nanodiscs, bicelles de^11,12,13 ,^14,15 et amphipols. ^{16 , 17} cependant, l’utilisation de détergents micelles reste une des approches plus courantes et les plus simples pour satisfaire aux exigences de la solubilité d’une protéine donnée. ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25} malheureusement, aucun détergent unique ou mélange magique de détergents n’existe actuellement qui satisfait à toutes les protéines de la membrane ; ainsi, ces conditions doivent être empiriquement dépistage pour les besoins uniques de chaque protéine. ^{26 , 27}

Détergents s’auto-assembler en solution au-dessus de leur concentration micellaire critique pour former des structures agrégées appelées micelles. Les micelles sont composés de nombreux monomères détergents (qui vont généralement de 20 à 200) avec chaînes alkyl hydrophobe, formant un noyau de micelles et les groupes de tête hydrophiles en une couche de coquille de micelle face à solvant aqueux. Le comportement de détergents et de la formation des micelles a été classiquement décrite par Charles Tanford dans L’effet hydrophobe, de²⁸ et de tailles et formes des micelles de détergents couramment utilisés dans les études de protéines membranaires ont été caractérisé à l’aide de petits angles diffusion. ^{29 , 30} organisme de détergent sur les protéines de la membrane a également été étudiée, et la formation des complexes protéine-détergent (PDC) est prévue avec les molécules de détergent entourant la protéine dans un arrangement qui ressemble à du détergent pur micelles. ³¹

On a ajouté avantage dans l’utilisation de détergents est que les propriétés de micelle qui en résulte peuvent être manipulées en incorporant d’autres détergents. De nombreux détergents pièce mélange idéal, et sélectionnez Propriétés de micelles mixtes peuvent même être prédites par les composants et le ratio de mélange. ²² Toutefois, la présence de détergent peut encore présentent des défis pour la caractérisation biophysique en contribuant au signal global. Par exemple, avec des rayons x et des techniques de diffusion de la lumière, signal de détergent dans le PDC est pratiquement impossible à distinguer de protéine. ³² enquêtes avec particule cryo microscopie électronique (cryo-EM) s’appuient généralement sur des particules (congelés) pris au piège ; des détails de structure de la protéine sont toujours cachés par certains détergents ou une forte concentration de détergent qui ajoute à l’arrière-plan. ³³ autres approches vers l’interprétation de la structure complète de PDC (y compris le détergent) ont été faites par des méthodes de calcul qui cherchent à reconstruire le détergent autour d’une protéine de membrane donnée. ³⁴

Dans le cas de la diffusion des neutrons, l’arrangement de noyau-enveloppe de détergent dans la micelle produit un facteur de forme qui contribue à la dispersion observée. Heureusement, les composants de la solution peuvent être modifiées telle qu’ils ne contribuent pas à la dispersion observée nette. Ce processus de « contraste correspondant » est réalisé en remplaçant le deutérium de l’hydrogène atteindre une densité de longueur de diffusion qui correspond à celle de l’arrière-plan (tampon). Un choix judicieux de détergent (avec des homologues deutérés disponibles) et de leur ratio de mélange doivent être considérés. Pour détergents micelles, cette substitution peut être effectuée à l’aide d’un détergent avec le même groupe de tête mais comportant une chaîne alkyle deutéré (d-queue au lieu de h-queue). Étant donné que les détergents sont bien mélangés,³⁵ leurs agrégats aura une densité de longueur de diffusion qui est la fraction molaire pondérée moyen des deux composantes (h-queues et d-queues). Lorsque ce contraste moyen correspond à celle du groupe de tête, les structures globales uniformes peuvent être entièrement assorties pour supprimer toutes les contributions à la dispersion observée.

Nous présentons ici un protocole visant à manipuler le contraste de neutrons des micelles détergents en incorporant des molécules de détergent chimiquement identiques avec des chaînes alkyles marqués au deutérium. ^{19 , 36 , 37} cette façon contraste simultané complet correspondant de micelle principale et de la coquille, qui est une capacité unique de diffusion des neutrons. ^{35 , 38} avec ce niveau sensiblement raffiné de détail, contraste correspondant peut activer sinon irréalisables études des structures des protéines membranaires. En outre, cette approche contraste équivalente pourrait être étendue à d’autres systèmes impliquant détergent comme polymère échange réactions³⁹ et huile-eau dispersants,⁴⁰ ou même d’autres agents solubilisants, tels que bicelles,⁴¹ nanodiscs,⁴² ou bloc copolymères. ⁴³ A approche similaire tel que décrit dans ce manuscrit, mais en employant une seule espèce de détergent avec des substitutions de deutérium partielle sur le groupe alkyle de chaîne et/ou de la tête, a été récemment publié. ³⁷ alors que cela est susceptible d’améliorer la répartition aléatoire de l’hydrogène et de deutérium dans le détergent par rapport à l’approche présentée ici, le nombre limité de postes disponibles sur le détergent de substitution et en deux étapes synthèse de détergent nécessaire pose des défis supplémentaires aux fins d’examen.

Les étapes 1 et 2 du protocole détaillés ci-dessous souvent se chevauchent car la première expérience de planification doit être faite pour présenter une proposition de qualité. Cependant, la proposition est considérée ici comme la première étape à souligner que ce processus doit être démarré bien avant une expérience de neutrons. Il est à noter également qu’une étape préalable, ce qui devrait être démontrée par la proposition, est d’avoir la caractérisation biochimique et physique (y compris la pureté et la stabilité) de l’échantillon soutenant la nécessité d’études de neutrons. Une discussion générale de neutrons de petits angles de diffusion (San) est abordée dans cet article. Une introduction brève mais complète est disponible dans l’ouvrage de référence, Caractérisation des matériaux par Kaufmann,⁴⁴ et une solution complète de manuels ciblée sur biologique petits angles de diffusion a été publié récemment. ⁴⁵ autres lectures recommandées est donnée dans la section « Discussion ». Diffusion petits angles utilise le vecteur de diffusion que l’on appelle Q la quantité central qui décrit le processus de diffusion. Cet article reprend la définition généralement acceptée Q = 4π sin (θ) / λ, où θ est la moitié l’angle entre le faisceau entrant et épars et λ est la longueur d’onde du rayonnement neutronique en angströms. Autres définitions existent qu’utilisation différente symboles tels que les de ‘ pour le vecteur de diffusion et qui peuvent différer par un facteur 2π ou à l’aide de nanomètres au lieu de Angstrom (voir aussi la discussion de la Figure 10).

Protocol

1. préparer et soumettre un Neutron installation faisceau temps Instrument et proposition Consulter les ressources en ligne pour l’identification des installations de diffusion de neutrons qui fournissent l’utilisateur générale neutrons faisceau temps accès, tels que l’Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Une carte des installations de neutrons et d’informations sur la recherche de neutrons dans le monde entier est disponible en ligne. 46 , sachez que ces installations ont g…

Representative Results

Une proposition d’instrument et de temps de faisceau doit exprimer clairement toutes les informations nécessaires au Comité de surveillance ainsi qu’une évaluation valable de l’expérience proposée peut être faite. Communication avec un NSS est fortement recommandée pour les utilisateurs inexpérimentés. Le SNRS peut évaluer la faisabilité initiale et soumission de proposition de guide pour souligner la faisabilité, la sécurité et le potentiel de fort impact science. Les…

Discussion

Chercheurs de biologie structurale tirer parti des techniques structurelles complémentaires comme solution de diffusion pour obtenir des détails biochimiques et structurales (tels que la taille globale et la forme) de molécules en solution. SANS est une technique particulièrement attractive pour la détermination des structures de faible résolution des protéines membranaires, un objectif de base de biochimie et de biologie structurale moderne. SANS nécessite des quantités de protéines purifiées comparables à c…

Materials

Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator	EMD Millipore	UFC905096	labware
Ammonium citrate dibasic	Fisher Scientific	A663	medium component
Ammonium sulfate	EMD Millipore	2150	medium component
Bioflo 310 Bioreactor System	Eppendorf	M1287-2110	equipment
Calcium chloride dihydrate	Acros	423525000	medium component
Carbenicillin	IBI Scientific	IB02025	antibiotic
Chloramphenicol	EMD Millipore	3130	antibiotic
Cobalt (II) chloride	Acros	AC21413-0050	medium component
Copper (II) sulfate	Acros	AC19771-1000	medium component
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	756822	medium component
Drierite Gas Purifier	W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.	27068
EDTA, disodium, dihydrate	EMD Millipore	4010	medium component
Emulsiflex-C3	Avestin	EF-C3	equipment
Äkta Purifier UPC100	GE Healthcare		equipment
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	medium component
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column	GE Healthcare	17116701
Imidazole	VWR	97064-622
IPTG	Teknova	I3325
Iron(III) chloride hexahydrate	MP Biochemicals	ICN19404590	medium component
LB Agar Miller	Fisher Scientific	BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate	VWR	97062-134	medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate	Acros	AC20590-5000	medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker	Thermo Scientific	SHKE6000-7	equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside	Anatrace	D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside	Anatrace	D310A
Potassium phosphate monobasic	VWR	97062-346	medium component
RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific Sorvall	46910	equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free	Sigma-Aldrich	S8830
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	795429
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S7907	medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane	VWR	28145-501	labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane	Thermo Scientific	596-4520	labware
Superdex 200 10/300 GL	GE Healthcare	17517501
Superose-12 10/300 GL column	GE Healthcare	17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter	GE Healthcare	80211630	equipment
Zinc sulfate monohydrate	Acros	AC38980-2500	medium component