JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

התאמת ניגודיות דטרגנט בניסויים פיזור ניוטרון זווית קטנה עבור ניתוח מבנה של חלבון ממברנה ומודלים Initio אלב

Published: October 21, 2018
doi:
10.3791/57901
, , , , ,
1Neutron Scattering Division,Oak Ridge National Laboratory, 2School of Chemistry and Biochemistry,Georgia Institute of Technology

Summary

פרוטוקול זה מדגים כיצד להשיג דגם ברזולוציה נמוכה ab initio ופרטים מבנית של חלבון הממברנה solubilized-חומרי ניקוי בתמיסה באמצעות פיזור ניוטרון זווית קטנה עם התאמת ניגודיות של הנוזל.

Abstract

המכשיר פיזור ביולוגי ניוטרון זווית קטנה במעבדה גבוהה השטף איזוטופ הכור של אלון רכס הלאומי מוקדש החקירה של חומרים ביולוגיים, biofuel עיבוד וחומרים בהשראה ביו כיסוי ננומטר ל מיקרומטר פיסיקליות. השיטות המובאות כאן על חקירת תכונות פיזיקליות (קרי, גודל וצורה) של קרום חלבונים (כאן, MmIAP, פרוטאז aspartyl intramembrane מן Methanoculleus marisnigri) בפתרונות של יוצרי מיצלה חומרי ניקוי? מתאים היטב לכלי פיזור זה זווית קטנה ניוטרון, בין היתר. טכניקות אחרות אפיון biophysical הם מוגבל בשל חוסר היכולת שלהם כדי לטפל דטרגנט סיועה של מבנה מורכב אבקת חלבון. בנוסף, גישה למעבדה ביו-Deuteration מספק יכולות ייחודיות הכנת cultivations בקנה מידה גדול ולבטא את התווית על-ידי דאוטריום חלבונים לאות פיזור משופר של החלבון. בזמן זה טכניקה אינו מספק פרטים מבניים ברזולוציה, הפער בידע מבניים קרום חלבונים מכיל הרבה תחומי המחקר למיעון ללא צורך ברזולוציה ליד-אטומית. לדוגמה, אזורים אלה לכלול נחישות של מדינות oligomeric, היווצרות מורכבות, שינויים הסתגלותי במהלך ההפרעות, קיפול/התגלגלות אירועים. חקירות אלה ניתן להשיג בקלות באמצעות יישומים של שיטה זו.

Introduction

קרום חלבונים מקודדים של % 30 המשוערת של גנים כל1 , מייצגים את רוב מטרות עבור תרופות מרפא מודרניים חזקים. 2 חלבונים אלה לבצע מגוון רחב של פונקציות חיוני הסלולר,3 אך למרות שפע וחשיבות שלהם – מייצג רק כ 1% של מבנים הכולל שהופקדו Collaboratory המחקר עבור חלבון ביואינפורמטיקה מבנית (RCSB) בנק מידע. 4 בשל טבעם הידרופובי חלקית, נחישות מבנית של חלבוני ממברנה מכורך כבר מאוד מאתגר. 5 , 6 , 7

טכניקות רבות biophysical דרוש monodisperse חלקיקים בתמיסה למדידה, בידוד מהחלבונים ממברנה מקורית ממברנות וייצוב חלבונים אלה ב לחקות מסיסים של הממברנות מקורי היה שטח פעיל של מחקר האחרונים עשורים. 8 , 9 , 10 חקירות אלה הובילו לפיתוח של הרכבות amphiphilic הרומן רבים solubilize קרום חלבונים, כגון nanodiscs,11,12,bicelles13 ,14,15 , amphipols. 16 , 17 . עם זאת, השימוש הקזאין דטרגנט נשאר לאחת הגישות הנפוצות ביותר וברור מספק את הדרישות מסיסות של חלבון נתון. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 . למרבה הצער, אין סבון יחיד או תערובת הקסם של דטרגנטים כיום קיימת המקיים את כל החלבונים ממברנה; לפיכך, התנאים האלה בטח מדעית שיוקרנו הדרישות הייחודיות של כל חלבון. 26 , 27

חומרי ניקוי עצמי להרכיב בפתרון מעל שלהם ריכוז קריטי מיצלה למבנים צבירה טופס שנקרא הקזאין. הקזאין המורכבות הרבה מונומרים דטרגנט (בדרך כלל בטווח שבין 20-200) עם שרשראות הידרופוביות אלקיל ויוצרים גרעין מיצלה וקבוצות ראש הידרופילית מסודרים בשכבה מעטפת מיצלה מול הממס מימית. ההתנהגות של חומרי ניקוי, היווצרות מיצלה שתיארנו בסגנון קלאסי על ידי צ’ארלס Tanford אפקט הידרופובי,28 , גדלים, צורות של הקזאין של דטרגנטים נפוץ במחקרים חלבון ממברנה היה מאופיין באמצעות פיזור זווית קטנה. 29 , 30 דטרגנט הארגון על קרום חלבונים גם נחקר, וצפויה היווצרות של חלבונים-דטרגנט מתחמי (שיתפקדו) עם מולקולות דטרגנט המקיפים את החלבון בהסדר הדומה הנוזל מסודר הקזאין. 31

אחד הוסיף היתרון בשימוש חומרי ניקוי היא כי ניתן לטפל המאפיינים מיצלה הנוצרת על-ידי שילוב חומרי ניקוי אחרות. חומרי ניקוי רבים שהפגינו ערבוב אידיאלי, אפילו ניתן לחזות בחר מאפייני הקזאין מעורבות מן הרכיבים ואת יחס של ערבוב. 22 . עם זאת, הנוכחות של דטרגנט יכול עדיין להציג אתגרים אפיוני biophysical בתרומה לחברה האות הכללית. לדוגמה, עם צילום רנטגן וטכניקות פיזור אור, האיתות דטרגנט ב PDC הוא כמעט להבחין מגניחותיה חלבון. 32 חקירות עם מיקרוסקופ יחיד-חלקיקים הקפאה-אלקטרונים (הקפאה-EM) בדרך כלל לסמוך על לכוד חלקיקים (קפואים); פרטים מבניים של החלבון מעורפלים. עדיין דטרגנטים מסוימים או ריכוז גבוה של חומרי ניקוי המוסיף הרקע. 33 גישות חלופיות לקראת פענוח המבנה PDC מלאה (כולל הנוזל) נעשו באמצעות שיטות אשר מבקשים לשחזר הנוזל סביב חלבון ממברנה נתון. 34

במקרה של פיזור ניוטרון, הסידור ליבה-קליפה של דטרגנט בתוך מיצלה מייצרת גורם טופס אשר תורמת פיזור התצפיות. למרבה המזל, ניתן לשנות רכיבי פתרון כזה כי הם לא תורמים פיזור התצפיות נטו. תהליך זה “חדות התאמת” מושגת על ידי החלפת דאוטריום מימן להשיג צפיפות אורך פיזור המתאים של הרקע (מאגר). יש לקחת בחשבון בחירה הביוספירה של דטרגנט (עם עמיתיהם deuterated זמין) ואת היחס של ערבוב. עבור הקזאין דטרגנט, החלפה זו יכולה להתבצע באמצעות חומר ניקוי עם אותה הקבוצה בראש אבל העובדה שרשרת אלקיל deuterated (d-הזנב במקום h-הזנב). מאז חומרי ניקוי היטב מעורבת,35 אגרגטים שלהם יש צפיפות אורך פיזור זה השבר-השומה משוקלל ממוצע של שני הרכיבים (h-פלי ו d-פלי). כאשר זה הניגוד הממוצע של ראש הקבוצה, המבנים צבירה במדים ניתן להתאים באופן מלא כדי להסיר את כל התרומות כדי פיזור התצפיות.

אנו מציגים כאן פרוטוקול לתמרן את הניגוד ניוטרון של דטרגנט הקזאין על-ידי שילוב מולקולות דטרגנט מבחינה כימית זהה עם התווית על-ידי דאוטריום אלקיל שרשראות. 19 , 36 , 37 זה מתיר מהניגודים סימולטני התאמת מיצלה core ו- shell, אשר היא יכולת ייחודית של פיזור ניוטרון. 35 , 38 עם רמת פירוט מעודן באופן משמעותי, התאמת ניגודיות יכול לאפשר לימודים אחרת ישים מבני חלבון ממברנה. בנוסף, גישה זו התאמת ניגודיות אפשרות להאריך למערכות אחרות הקשורות דטרגנט, כגון פולימר חילופי תגובות39 ו שמן מים dispersants,40 או אפילו סוכנים אחרים, solubilizing, כגון bicelles,41 copolymers nanodiscs,42 או לחסום. גישה דומה 43 א כמתואר כתב יד זה, אבל העסקת זן דטרגנט יחיד עם החלפות חלקיות דאוטריום-אלקיל שרשרת ו/או ראש הקבוצה, יצא לאור לאחרונה. 37 בזמן זה צפויים לשפר את התפלגות אקראית של מימן, דאוטריום בכל רחבי הנוזל לעומת הגישה המובאת כאן, מספר מוגבל של משרות פתוחות על החומר ניקוי עבור החלפת ושני שלבים סינתזה דטרגנט נדרש מציבה אתגרים נוספים בתמורה.

שלבים 1 ו- 2 של פרוטוקול שיפורטו להלן לעתים קרובות חופפים מאז תכנון הניסוי הראשוני חייב להיעשות להגיש הצעה איכות. עם זאת, הצעת הגשה נחשב כאן בתור הצעד הראשון כדי להדגיש כי תהליך זה אמורה להתחיל הרבה לפני ניסוי ניוטרון. יש גם לציין כי צעד דרישה מוקדמת, אשר צריך ניתן להדגים על ידי ההצעה, הוא שתהיה הביוכימי ופיזית אפיון (כולל טוהר ויציבות) הדגימה התומכים בצורך לימודי ניוטרון. דיון כללי של זווית קטנה ניוטרון פיזור (SAN) חורג מהיקף מאמר זה. הקדמה קצרה אך יסודי זמין העבודה הפניה ואפיון של חומרים על ידי קאופמן,44 וספר לימוד ממוקד ביולוגי זווית קטנה פתרון מקיף פיזור שפורסם לאחרונה. 45 עוד המלצה לקריאה ניתנת במקטע דיון. זווית קטנה פיזור משתמש הווקטור פיזור שנקרא Q הכמות המרכזי המתאר את תהליך פיזור. מאמר זה משתמש בהגדרת נפוצה ומקובלת Q = חטא 4π (θ באמצעות) / λ, איפה θ באמצעות חצי הזווית בין קרן פזורים ונכנסות λ הוא אורך הגל של הקרינה ניוטרון ב אנגסטרום. הגדרות אחרות קיים שימוש שונה סמלים כגון של ‘ עבור וקטור פיזור, וכי עשויים להשתנות על ידי 2π פקטור או באמצעות ננומטר במקום אנגסטרום (ראה גם הדיון איור 10).

Protocol

1. להכין ולהגיש ניוטרון מתקן קרן ושעה כלי הצעה התייעץ עם משאבים מקוונים לזיהוי ניוטרון פיזור מתקנים המאפשרים כללי למשתמש ניוטרון קרן זמן גישה, כגון אוק רידג הלאומית מעבדה (ORNL). מפה של נייטרונים מתקני ומידע אודות ניוטרון מחקר ברחבי העולם זמין באינטרנט. 46 להיות מודע כי מתקנ?…

Representative Results

הצעה וזמן מכשיר קרן ברור צריך להעביר את כל המידע הדרוש לוועדה סקירה כך הערכה חוקית של הניסוי המוצע יכול להתבצע. תקשורת עם תוכנית השירות NSS הוא הציע מאוד עבור משתמשים לא מנוסים. תוכנית השירות NSS יכול להעריך היתכנות ראשונית ואת מדריך הקרן כדי להדגיש היתכנות, בטיחות, ואת הפוט?…

Discussion

החוקרים בביולוגיה מבנית לנצל משלימים טכניקות מבניים כמו פתרון פיזור להשיג פרטים הביוכימי ומבניים (כגון הכולל גודל וצורה) של מולקולות בפתרון. SANS הוא טכניקה אטרקטיביים במיוחד לצורך קביעת מבנים ברזולוציה נמוכה של קרום חלבונים, מוקד הליבה של ביולוגיה מבנית מודרנית וביוכימיה. SANS דורשת כמויות…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המשרד של ביולוגי, המחקר הסביבתי נתמכת מחקר במרכז של ORNL ביולוגיה מולקולרית מבנית (CSMB), ביו-SANS באמצעות מתקני נתמך על ידי מדעי משתמש מתקני החלוקה, Office Basic אנרגיה למדעים, מחלקת אותנו של אנרגיה. עבודה מבניים על קרום חלבונים במעבדה ליברמן בתמיכתם NIH (DK091357, GM095638), ה-NSF (0845445).

Materials

Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator  EMD Millipore UFC905096 labware
Ammonium citrate dibasic Fisher Scientific A663 medium component
Ammonium sulfate EMD Millipore 2150 medium component
Bioflo 310 Bioreactor System Eppendorf M1287-2110 equipment
Calcium chloride dihydrate Acros 423525000 medium component
Carbenicillin IBI Scientific IB02025 antibiotic
Chloramphenicol EMD Millipore 3130 antibiotic
Cobalt (II) chloride Acros AC21413-0050 medium component
Copper (II) sulfate Acros AC19771-1000  medium component
Deuterium oxide Sigma-Aldrich 756822 medium component
Drierite Gas Purifier W.A. Hammond Drierite Co. Ltd. 27068
EDTA, disodium, dihydrate EMD Millipore 4010 medium component
Emulsiflex-C3 Avestin EF-C3 equipment
Äkta Purifier UPC100 GE Healthcare  equipment
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 medium component
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column GE Healthcare  17116701
Imidazole VWR 97064-622
IPTG Teknova I3325
Iron(III) chloride hexahydrate MP Biochemicals ICN19404590 medium component
LB Agar Miller Fisher Scientific BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-134 medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate Acros AC20590-5000 medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker Thermo Scientific SHKE6000-7  equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside Anatrace D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310A
Potassium phosphate monobasic VWR 97062-346 medium component
RC 6 Plus Centrifuge Thermo Scientific Sorvall 46910 equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free Sigma-Aldrich S8830
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane VWR 28145-501 labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane Thermo Scientific 596-4520  labware
Superdex 200 10/300 GL  GE Healthcare  17517501
Superose-12 10/300 GL column  GE Healthcare  17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter GE Healthcare  80211630 equipment
Zinc sulfate monohydrate Acros AC38980-2500  medium component
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wallin, E., Heijne, G. V. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Science. 7 (4), 1029-1038 (1998).
  2. Tautermann, C. S. GPCR structures in drug design, emerging opportunities with new structures. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24 (17), 4073-4079 (2014).
  3. Cournia, Z., et al. Membrane protein structure, function, and dynamics: A perspective from experiments and theory. The Journal of Membrane Biology. 248 (4), 611-640 (2015).
  4. Doerr, A. Membrane protein structures. Nature Methods. 6, 35 (2008).
  5. Bill, R. M., et al. Overcoming barriers to membrane protein structure determination. Nature Biotechnology. 29, 335 (2011).
  6. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
  7. Sanders, C. R., Sönnichsen, F. Solution NMR of membrane proteins: Practice and challenges. Magnetic Resonance in Chemistry. 44 (S1), S24-S40 (2006).
  8. Garavito, R. M., Ferguson-Miller, S. Detergents as tools in membrane biochemistry. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 32403-32406 (2001).
  9. Privé, G. G. Detergents for the stabilization and crystallization of membrane proteins. Methods. 41 (4), 388-397 (2007).
  10. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  11. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  12. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  13. Skar-Gislinge, N., et al. Elliptical structure of phospholipid bilayer nanodiscs encapsulated by scaffold proteins: Casting the roles of the lipids and the protein. Journal of the American Chemical Society. 132 (39), 13713-13722 (2010).
  14. Sanders, C. R., Schwonek, J. P. Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. 생화학. 31 (37), 8898-8905 (1992).
  15. Vestergaard, M., Kraft, J. F., Vosegaard, T., Thøgersen, L., Schiøtt, B. Bicelles and other membrane mimics: comparison of structure, properties, and dynamics from MD simulations. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (52), 15831-15843 (2015).
  16. Popot, J. -. L., et al. Amphipols From A to Z. Annual Review of Biophysics. 40 (1), 379-408 (2011).
  17. Tribet, C., Audebert, R., Popot, J. -. L. Amphipols: Polymers that keep membrane proteins soluble in aqueous solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93 (26), 15047 (1996).
  18. Fernández, C., Wüthrich, K. NMR solution structure determination of membrane proteins reconstituted in detergent micelles. FEBS Letters. 555 (1), 144-150 (2003).
  19. Hiruma-Shimizu, K., Shimizu, H., Thompson, G. S., Kalverda, A. P., Patching, S. G. Deuterated detergents for structural and functional studies of membrane proteins: Properties, chemical synthesis and applications. Molecular Membrane Biology. 32 (5-8), 139-155 (2015).
  20. Krueger-Koplin, R. D., et al. An evaluation of detergents for NMR structural studies of membrane proteins. Journal of Biomolecular NMR. 28 (1), 43-57 (2004).
  21. Linke, D., Burgess, R. R., Deutscher, M. P. . Methods in Enzymology. 463, 603-617 (2009).
  22. Oliver, R. C., et al. Tuning micelle dimensions and properties with binary surfactant mixtures. Langmuir. 30 (44), 13353-13361 (2014).
  23. Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
  24. Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Reviews on Biomembranes. 457 (2), 133-170 (1976).
  25. Tulumello, D. V., Deber, C. M. Efficiency of detergents at maintaining membrane protein structures in their biologically relevant forms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1818 (5), 1351-1358 (2012).
  26. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. Tanford, C. . The Hydrophobic Effect: Formation of Micelles and Biological Membranes. , (1980).
  29. Littrell, K., Urban, V., Tiede, D., Thiyagarajan, P. Solution structure of detergent micelles at conditions relevant to membrane protein crystallization. Journal of Applied Crystallography. 33 (3 Part 1), 577-581 (2000).
  30. Oliver, R. C., et al. Dependence of micelle size and shape on detergent alkyl chain length and head group. PLOS ONE. 8 (5), e62488 (2013).
  31. Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  32. Hong, X., Weng, Y. -. X., Li, M. Determination of the topological shape of integral membrane protein light-harvesting complex LH2 from photosynthetic bacteria in the detergent solution by small-angle X-ray scattering. Biophysical Journal. 86 (2), 1082-1088 (2004).
  33. Vinothkumar, K. R. Membrane protein structures without crystals, by single particle electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 33, 103-114 (2015).
  34. Pérez, J., Koutsioubas, A. Memprot: A program to model the detergent corona around a membrane protein based on S-SAXS data. Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 86-93 (2015).
  35. Oliver, R. C., Pingali, S. V., Urban, V. S. Designing mixed detergent micelles for uniform neutron contrast. The Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (20), 5041-5046 (2017).
  36. Hiruma-Shimizu, K., Kalverda, A. P., Henderson, P. J. F., Homans, S. W., Patching, S. G. Synthesis of uniformly deuterated n-dodecyl-β-D-maltoside (d39-DDM) for solubilization of membrane proteins in TROSY NMR experiments. Journal of Labelled Compounds & Radiopharmaceuticals. 57 (14), 737-743 (2014).
  37. Midtgaard, S. R., et al. Invisible detergents for structure determination of membrane proteins by small-angle neutron scattering. The FEBS Journal. 285 (2), 357-371 (2018).
  38. Gabel, F., Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S. . Biological Small Angle Scattering: Techniques, Strategies and Tips. , 201-214 (2017).
  39. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO Block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50 (6), 2484-2494 (2017).
  40. Liyana-Arachchi, T. P., et al. Bubble bursting as an aerosol generation mechanism during an oil spill in the deep-sea environment: Molecular dynamics simulations of oil alkanes and dispersants in atmospheric air/salt water interfaces. Environmental Science: Processes & Impacts. 16 (1), 53-64 (2014).
  41. Dos Santos Morais, R., et al. Contrast-matched isotropic bicelles: A versatile tool to specifically probe the solution structure of peripheral membrane proteins using SANS. Langmuir. 33 (26), 6572-6580 (2017).
  42. Maric, S., et al. Stealth carriers for low-resolution structure determination of membrane proteins in solution. Acta Crystallographica Section D. 70 (2), 317-328 (2014).
  43. Pedersen, J. S., Svaneborg, C., Almdal, K., Hamley, I. W., Young, R. N. A small-angle neutron and x-ray contrast variation scattering study of the structure of block copolymer micelles: Corona shape and excluded volume interactions. Macromolecules. 36 (2), 416-433 (2003).
  44. Urban, V. S., Kaufmann, E. N. . Characterization of Materials. , (2012).
  45. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S., Cohen, I. R., et al. . Advances in Experimental Medicine and Biology. 1009, 1-268 (2017).
  46. . Submitting a Research Proposal Available from: https://neutrons.ornl.gov/users/proposals (2018)
  47. . Accompanying Bio-Deuteration Laboratory Proposal Available from: https://www.ornl.gov/sites/default/files/BDL_info_request.docx (2014)
  48. Whitten, A. E., Cai, S., Trewhella, J. MULCh: Modules for the analysis of small-angle neutron contrast variation data from biomolecular assemblies. Journal of Applied Crystallography. 41 (1), 222-226 (2008).
  49. . Scattering Length Density Calculator by National Institute of Standards and Technology (NIST) Center for Neutron Research Available from: https://www.ncnr.nist.gov/resources/activation/ (2018)
  50. Ibel, K., Stuhrmann, H. B. Comparison of neutron and X-ray scattering of dilute myoglobin solutions. Journal of Molecular Biology. 93 (2), 255-265 (1975).
  51. Holme, T., Arvidson, S., Lindholm, B., Pavlu, B. Enzymes: Laboratory-scale production. Process Biochemistry. 5 (9), 62-66 (1970).
  52. Larsson, G., Enfors, S. -. O. Protein release and foaming in Escherichia coli cultures grown in minimal medium. Bioprocess Engineering. 15 (5), 231-237 (1996).
  53. Artero, J. -. B., Hartlein, M., McSweeney, S., Timmins, P. A comparison of refined X-ray structures of hydrogenated and perdeuterated rat [gamma]E-crystallin in H2O and D2O. Acta Crystallographica Section D. 61 (11), 1541-1549 (2005).
  54. Paliy, O., Bloor, D., Brockwell, D., Gilbert, P., Barber, J. Improved methods of cultivation and production of deuteriated proteins from E. coli strains grown on fully deuteriated minimal medium. Journal of applied microbiology. 94 (4), 580-586 (2003).
  55. Sivashanmugam, A., et al. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Science. 18 (5), 936-948 (2009).
  56. Hoopes, J. T., Elberson, M. A., Preston, R. J., Reddy, P. T., Kelman, Z., Kelman, Z. . Methods in Enzymology. 565, 27-44 (2015).
  57. Leiting, B., Marsilio, F., O’Connell, J. F. Predictable deuteration of recombinant proteins expressed in Escherichia coli. Analytical Biochemistry. 265 (2), 351-355 (1998).
  58. Perkins, S. J. Estimation of deuteration levels in whole cells and cellular proteins by 1H n.m.r. spectroscopy and neutron scattering. Biochemical Journal. 199 (1), 163-170 (1981).
  59. Obom, K. M., Magno, A., Cummings, P. J. Operation of a benchtop bioreactor. Journal of Visualized Experiments. (79), e50582 (2013).
  60. Duff, A. P., Wilde, K. L., Rekas, A., Lake, V., Holden, P. J., Kelman, Z. . Methods in Enzymology. 565, 3-25 (2015).
  61. Haertlein, M., Kelman, Z., et al. . Methods in Enzymology. 566, 113-157 (2016).
  62. Meilleur, F., Weiss, K. L., Myles, D. A. A. T Micro and Nano Technologies in Bioanalysis. Methods in Molecular Biology. 544, 281-292 (2009).
  63. Naing, S. -. H., Oliver, R. C., Weiss, K. L., Urban, V. S., Lieberman, R. L. Solution structure of an intramembrane aspartyl protease via small angle neutron scattering. Biophysical Journal. 114 (3), 602-608 (2018).
  64. . Training Requirements for First Time and Repeat Users Available from: https://neutrons.ornl.gov/users (2018)
  65. . Remote Analysis Cluster Available from: https://analysis.sns.gov (2018)
  66. Franke, D., et al. ATSAS 2.8: A comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).
  67. . Software Suite Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html (2018)
  68. . Software Individual Programs Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/software.html (2018)
  69. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: A Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1277-1282 (2003).
  70. Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Science. 19 (4), 642-657 (2010).
  71. Svergun, D. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25 (4), 495-503 (1992).
  72. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40 (3), 191-285 (2007).
  73. Svergun, D. I., et al. Protein hydration in solution: Experimental observation by x-ray and neutron scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2267-2272 (1998).
  74. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 342-346 (2009).
  75. Svergun, D. I. Restoring Low Resolution Structure of Biological Macromolecules from Solution Scattering Using Simulated Annealing. Biophysical Journal. 76 (6), 2879-2886 (1999).
  76. Jacques, D. A., Guss, J. M., Svergun, D. I., Trewhella, J. Publication guidelines for structural modelling of small-angle scattering data from biomolecules in solution. Acta Crystallographica Section D. 68 (6), 620-626 (2012).
  77. Heller, W. T., et al. The Bio-SANS instrument at the High Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory. Journal of Applied Crystallography. 47 (4), 1238-1246 (2014).
  78. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution. Reports on Progress in Physics. 66 (10), 1735 (2003).
  79. Johnson, J. L., Kalyoncu, S., Lieberman, R. L., Mus-Veteau, I. . Heterologous Expression of Membrane Proteins: Methods and Protocols. , 281-301 (2016).

Tags

Membrane ProteinSmall-angle Neutron ScatteringContrast MatchingDeuterium LabelingAb Initio ModelingOligomeric StateSizeShapeLow Resolution StructureDetergentScattering Length DensityContrast Match PointE. ColiDeuterated ProteinMinimal MediumBioreactor
check_url/kr/57901?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Oliver, R. C., Naing, S., Weiss, K. L., Pingali, S. V., Lieberman, R. L., Urban, V. S. Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling. J. Vis. Exp. (140), e57901, doi:10.3791/57901 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image