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생화학

इसके विपरीत-झिल्ली प्रोटीन संरचनात्मक विश्लेषण और अटल बिहारी Initio मॉडलिंग के लिए छोटे कोण न्यूट्रॉन तितर बितर प्रयोगों में डिटर्जेंट मिलान

Published: October 21, 2018
doi:
10.3791/57901
, , , , ,
1Neutron Scattering Division,Oak Ridge National Laboratory, 2School of Chemistry and Biochemistry,Georgia Institute of Technology

Summary

इस प्रोटोकॉल को दर्शाता है कैसे एक कम संकल्प एबी initio मॉडल और एक डिटर्जेंट-solubilized झिल्ली प्रोटीन के संरचनात्मक विवरण के समाधान में छोटे कोण न्यूट्रॉन बिखरने का उपयोग करने के विपरीत-डिटर्जेंट के मिलान के साथ प्राप्त करने के लिए ।

Abstract

जैविक छोटे कोण न्यूट्रॉन तितर बितर साधन ओक रिज राष्ट्रीय प्रयोगशाला के उच्च प्रवाह आइसोटोप रिएक्टर में जैविक सामग्री की जांच करने के लिए समर्पित है, जैव ईंधन प्रसंस्करण, और जैव प्रेरित सामग्री को कवर करने के लिए नैनोमीटर माइक्रोमीटर लंबाई तराजू । शारीरिक गुणों की जांच के लिए यहां प्रस्तुत तरीकों (यानी, आकार और आकार) झिल्ली प्रोटीन की (यहां, MmIAP, एक intramembrane aspartyl Methanoculleus marisnigriसे चिढ़ा) micelle के समाधान में डिटर्जेंट बनाने इस छोटे कोण न्यूट्रॉन तितर बितर साधन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल, दूसरों के बीच । अंय भौतिक लक्षण वर्णन तकनीक उनकी अक्षमता को एक प्रोटीन-डिटर्जेंट जटिल संरचना में डिटर्जेंट योगदान पते से बाधा है । इसके अतिरिक्त, जैव Deuteration प्रयोगशाला के लिए उपयोग बड़े पैमाने पर खेती की तैयारी और प्रोटीन से बढ़ाया तितर बितर संकेत के लिए ड्यूटेरियम-लेबल प्रोटीन व्यक्त करने के लिए अद्वितीय क्षमताओं प्रदान करता है । हालांकि इस तकनीक के उच्च संकल्प पर संरचनात्मक विवरण प्रदान नहीं करता है, झिल्ली प्रोटीन के लिए संरचनात्मक ज्ञान अंतर के पास परमाणु संकल्प की आवश्यकता के बिना अनुसंधान के कई क्षेत्रों के पते शामिल हैं । उदाहरण के लिए, इन क्षेत्रों में oligomeric राज्यों के निर्धारण, जटिल गठन, गड़बड़ी के दौरान संरचना परिवर्तन, और तह/ इन जांच आसानी से इस पद्धति के अनुप्रयोगों के माध्यम से पूरा किया जा सकता है ।

Introduction

झिल्ली प्रोटीन सभी जीन1 के एक अनुमानित 30% से इनकोडिंग और आधुनिक औषधीय दवाओं के लिए लक्ष्य का एक मजबूत बहुमत का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । 2 इन प्रोटीन महत्वपूर्ण सेलुलर कार्यों की एक विस्तृत सरणी प्रदर्शन,3 लेकिन उनके बहुतायत और महत्व के बावजूद-केवल संरचनात्मक Bioinformatics (RCSB) प्रोटीन के लिए अनुसंधान Collaboratory में जमा कुल संरचनाओं के बारे में 1% का प्रतिनिधित्व डेटा बैंक । 4 उनके आंशिक रूप से hydrophobic प्रकृति के कारण, झिल्ली बंधे प्रोटीन के संरचनात्मक संकल्प बेहद चुनौतीपूर्ण हो गया है । 5 , 6 , 7

के रूप में कई भौतिक तकनीक माप के लिए समाधान में monodisperse कणों की आवश्यकता होती है, देशी झिल्ली से झिल्ली प्रोटीन अलग और एक घुलनशील देशी झिल्ली की नकल में इन प्रोटीन स्थिर अनुसंधान के एक सक्रिय क्षेत्र रहा है हाल ही में दशकों. 8 , 9 , 10 इन जांचों ने कई उपन्यास amphiphilic सभाओं के विकास के लिए नेतृत्व किया है solubilize झिल्ली प्रोटीन, जैसे nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 और amphipols । 16 , 17 हालांकि, डिटर्जेंट micelles का उपयोग एक दिया प्रोटीन की घुलनशीलता आवश्यकताओं को संतोषजनक करने के लिए सबसे आम और सीधा दृष्टिकोण में से एक रहता है । 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 दुर्भाग्य से, कोई भी डिटर्जेंट या डिटर्जेंट का जादू मिश्रण वर्तमान में मौजूद है कि सभी झिल्ली प्रोटीन संतुष्ट; इस प्रकार, इन शर्तों empirically प्रत्येक प्रोटीन की अनूठी आवश्यकताओं के लिए जांच की जानी चाहिए । 26 , 27

डिटर्जेंट स्वयं अपने महत्वपूर्ण micelle एकाग्रता के ऊपर समाधान में इकट्ठा करने के लिए कुल संरचनाओं micelles बुलाया फार्म । Micelles कई डिटर्जेंट मोनोमर से बना रहे है (आमतौर पर 20-200 से लेकर) hydrophobic alkyl जंजीरों के साथ एक micelle कोर और हाइड्रोफिलिक सिर एक micelle खोल जलीय विलायक सामना परत में व्यवस्था समूहों के गठन । डिटर्जेंट और micelle गठन का व्यवहार क्लासिक Hydrophobic प्रभावमें चार्ल्स Tanford द्वारा वर्णित किया गया है,28 और आकारों और आकार और झिल्ली प्रोटीन अध्ययन में आमतौर पर इस्तेमाल किया डिटर्जेंट से micelles छोटे कोण बिखरने का उपयोग कर विशेषता । 29 , झिल्ली प्रोटीन के बारे में 30 डिटर्जेंट संगठन भी अध्ययन किया गया है, और प्रोटीन के गठन-डिटर्जेंट परिसर (पीडीसी) डिटर्जेंट एक व्यवस्था है कि साफ डिटर्जेंट जैसा दिखता है में प्रोटीन आसपास के अणुओं के साथ की उंमीद है micelles । 31

डिटर्जेंट का उपयोग करने में एक जोड़ा लाभ यह है कि जिसके परिणामस्वरूप micelle गुण अंय डिटर्जेंट शामिल द्वारा चालाकी से किया जा सकता है । कई डिटर्जेंट आदर्श मिश्रण का प्रदर्शन, और मिश्रित micelles के गुण का चयन भी घटकों और मिश्रण के अनुपात से भविष्यवाणी की जा सकती है । 22 हालांकि, डिटर्जेंट की उपस्थिति अभी भी भौतिक characterizations के लिए चुनौतियों का समग्र संकेत करने के लिए योगदान द्वारा मौजूद कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, एक्स-रे और प्रकाश बिखरने तकनीक के साथ, PDC में डिटर्जेंट से संकेत व्यावहारिक रूप से प्रोटीन से अलग है । एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-EM) के साथ ३२ जांच आम तौर पर फंस (जमे हुए) कणों पर भरोसा करते हैं; प्रोटीन के संरचनात्मक विवरण अभी भी कुछ डिटर्जेंट या डिटर्जेंट की एक उच्च एकाग्रता है जो पृष्ठभूमि के लिए कहते हैं द्वारा अस्पष्ट हैं । ३३ पूर्ण PDC संरचना (डिटर्जेंट सहित) की व्याख्या की ओर वैकल्पिक दृष्टिकोण गणना के तरीके जो एक दिया झिल्ली प्रोटीन के आसपास डिटर्जेंट पुनर्निर्माण की तलाश के माध्यम से किया गया है । ३४

न्यूट्रॉन कैटरिंग के मामले के लिए, micelle में डिटर्जेंट की कोर-शैल व्यवस्था एक फार्म का कारक है जो मनाया तितर बितर करने के लिए योगदान देता है । सौभाग्य से, समाधान घटकों को इस तरह बदला जा सकता है कि वे नेट में योगदान नहीं तितर बितर मनाया । इस “विपरीत मिलान प्रक्रिया” हाइड्रोजन के लिए प्रतिस्थापन ड्यूटेरियम द्वारा प्राप्त करने के लिए एक तितर बितर लंबाई घनत्व है कि मैच पृष्ठभूमि (बफर) की है । डिटर्जेंट की एक विवेकपूर्ण विकल्प (उपलब्ध deuterated समकक्षों के साथ) और मिश्रण के अपने अनुपात पर विचार किया जाना चाहिए । डिटर्जेंट micelles के लिए, इस प्रतिस्थापन एक ही सिर समूह के साथ एक डिटर्जेंट का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन एक deuterated alkyl श्रृंखला होने (डी के बजाय एच पूंछ पूंछ) । चूंकि डिटर्जेंट अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे हैं,३५ उनके समुच्चय एक तितर बितर लंबाई घनत्व है कि दो घटकों के तिल अंश भारित औसत है (एच पूंछ और डी पूंछ) होगा । जब इस औसत कंट्रास्ट सिर समूह की है कि के साथ संगत है, वर्दी समग्र संरचनाओं पूरी तरह से मनाया तितर बितर करने के लिए सभी योगदान को हटाने के लिए मिलान किया जा सकता है ।

हम यहां मौजूद एक प्रोटोकॉल ड्यूटेरियम-लेबल alkyl जंजीरों के साथ रासायनिक समान डिटर्जेंट अणुओं को शामिल करके डिटर्जेंट micelles के न्यूट्रॉन कंट्रास्ट में हेरफेर करने के लिए । 19 , ३६ , ३७ यह micelle कोर और शेल, जो न्यूट्रॉन कैटरिंग की एक अनूठी क्षमता है की एक साथ विपरीत मिलान पूरा परमिट । ३५ , विस्तार के इस महत्वपूर्ण परिष्कृत स्तर के साथ ३८ , इसके विपरीत मिलान झिल्ली प्रोटीन संरचनाओं के अंयथा व्यावहारिक अध्ययन सक्षम कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, इस विपरीत मिलान दृष्टिकोण ऐसे बहुलक विनिमय प्रतिक्रियाओं३९ और तेल-पानी dispersants,४० या यहां तक कि अंय solubilizing एजेंटों, जैसे डिटर्जेंट, शामिल अंय प्रणालियों के लिए बढ़ाया जा सकता है bicelles,४१ के रूप में nanodiscs,४२ या ब्लॉक copolymers. ४३ इस पांडुलिपि में उल्लिखित के रूप में एक समान दृष्टिकोण है, लेकिन alkyl चेन और/या सिर समूह पर आंशिक ड्यूटेरियम प्रतिस्थापन के साथ एक भी डिटर्जेंट प्रजातियों को रोजगार हाल ही में प्रकाशित किया गया था । ३७ जबकि यह हाइड्रोजन और ड्यूटेरियम के यादृच्छिक वितरण में सुधार की उंमीद की जा सकती है यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण की तुलना में डिटर्जेंट भर, प्रतिस्थापन और दो के लिए डिटर्जेंट पर उपलब्ध पदों की सीमित संख्या-कदम डिटर्जेंट संश्लेषण पर विचार के लिए अतिरिक्त चुनौतियों बन गया आवश्यक है ।

चरण 1 और 2 प्रोटोकॉल के नीचे विस्तृत अक्सर प्रारंभिक प्रयोग योजना के बाद से ओवरलैप करने के लिए एक गुणवत्ता प्रस्ताव प्रस्तुत किया जाना चाहिए । हालांकि, प्रस्ताव प्रस्तुत करने पर जोर दिया है कि इस प्रक्रिया को एक न्यूट्रॉन प्रयोग के अग्रिम में अच्छी तरह से शुरू किया जाना चाहिए पहले कदम के रूप में यहां माना जाता है । यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक शर्त कदम है, जो प्रस्ताव द्वारा प्रदर्शन किया जाना चाहिए, के लिए जैव रासायनिक और भौतिक लक्षण वर्णन है (शुद्धता और स्थिरता सहित) न्यूट्रॉन अध्ययन की आवश्यकता का समर्थन नमूना । छोटे कोण न्यूट्रॉन कैटरिंग (बिना) के एक सामान्य चर्चा इस लेख के दायरे से बाहर है. एक संक्षिप्त लेकिन पूरी तरह से परिचय Kaufmann,४४ और एक व्यापक जैविक छोटे कोण समाधान तितर बितर पर ध्यान केंद्रित पाठ्यपुस्तक द्वारा सामग्री के संदर्भ काम लक्षण वर्णन में उपलब्ध है हाल ही में प्रकाशित किया गया है । ४५ आगे की सिफारिश की पढ़ने चर्चा अनुभाग में दिया जाता है । छोटे कोण बिखरने का उपयोग करता है तथाकथित कैटरिंग वेक्टर क्यू के रूप में केंद्रीय मात्रा है कि तितर बितर प्रक्रिया का वर्णन करता है । यह आलेख व्यापक रूप से स्वीकृत परिभाषा Q = 4π सिन (θ)/λ का उपयोग करता है, जहां θ आवक और बिखरी किरण के बीच आधा कोण है और λ में न्यूट्रॉन विकिरण की तरंग दैर्ध्य Angstroms है. अंय परिभाषाएं मौजूद है कि इस तरह के ‘ के रूप में बिखरने वेक्टर के लिए विभिंन प्रतीकों का उपयोग करें, और है कि एक कारक 2π द्वारा या Angstrom के स्थान पर nanometers का उपयोग करके अलग हो सकता है ( चित्रा 10की भी चर्चा देखें) ।

Protocol

1. एक न्यूट्रॉन सुविधा बीम समय और साधन प्रस्ताव तैयार करने और प्रस्तुत सामान्य उपयोगकर्ता न्यूट्रॉन बीम समय पहुँच, जैसे ओक रिज राष्ट्रीय प्रयोगशाला (ORNL) प्रदान न्यूट्रॉन कैटरिंग सुविधाओं की पहचान ?…

Representative Results

एक बीम समय और साधन प्रस्ताव स्पष्ट रूप से समीक्षा समिति के लिए आवश्यक सभी जानकारी देना चाहिए ताकि प्रस्तावित प्रयोग का एक वैध मूल्यांकन किया जा सकता है । एक एनएसएस के साथ संचार अत्यधिक अनु?…

Discussion

संरचनात्मक जीवविज्ञान शोधकर्ताओं समाधान में जैव रासायनिक और संरचनात्मक विवरण (जैसे समग्र आकार और आकार के रूप में) प्राप्त करने के लिए हल बिखरने की तरह पूरक संरचनात्मक तकनीक का लाभ ले लो । संस झिल्ली प?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

जैव और पर्यावरण अनुसंधान के कार्यालय ORNL संरचनात्मक आणविक जीव विज्ञान (CSMB) और जैव के लिए केंद्र में अनुसंधान समर्थित वैज्ञानिक उपयोगकर्ता सुविधाएं प्रभाग, बुनियादी ऊर्जा विज्ञान, अमेरिकी विभाग के कार्यालय द्वारा समर्थित सुविधाओं का उपयोग कर की ऊर्जा । Lieberman लैब में झिल्ली प्रोटीन पर संरचनात्मक कार्य NIH (DK091357, GM095638) और NSF (०८४५४४५) द्वारा समर्थित किया गया है ।

Materials

Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator  EMD Millipore UFC905096 labware
Ammonium citrate dibasic Fisher Scientific A663 medium component
Ammonium sulfate EMD Millipore 2150 medium component
Bioflo 310 Bioreactor System Eppendorf M1287-2110 equipment
Calcium chloride dihydrate Acros 423525000 medium component
Carbenicillin IBI Scientific IB02025 antibiotic
Chloramphenicol EMD Millipore 3130 antibiotic
Cobalt (II) chloride Acros AC21413-0050 medium component
Copper (II) sulfate Acros AC19771-1000  medium component
Deuterium oxide Sigma-Aldrich 756822 medium component
Drierite Gas Purifier W.A. Hammond Drierite Co. Ltd. 27068
EDTA, disodium, dihydrate EMD Millipore 4010 medium component
Emulsiflex-C3 Avestin EF-C3 equipment
Äkta Purifier UPC100 GE Healthcare  equipment
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 medium component
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column GE Healthcare  17116701
Imidazole VWR 97064-622
IPTG Teknova I3325
Iron(III) chloride hexahydrate MP Biochemicals ICN19404590 medium component
LB Agar Miller Fisher Scientific BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate VWR 97062-134 medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate Acros AC20590-5000 medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker Thermo Scientific SHKE6000-7  equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside Anatrace D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310A
Potassium phosphate monobasic VWR 97062-346 medium component
RC 6 Plus Centrifuge Thermo Scientific Sorvall 46910 equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free Sigma-Aldrich S8830
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane VWR 28145-501 labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane Thermo Scientific 596-4520  labware
Superdex 200 10/300 GL  GE Healthcare  17517501
Superose-12 10/300 GL column  GE Healthcare  17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter GE Healthcare  80211630 equipment
Zinc sulfate monohydrate Acros AC38980-2500  medium component
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Oliver, R. C., Naing, S., Weiss, K. L., Pingali, S. V., Lieberman, R. L., Urban, V. S. Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling. J. Vis. Exp. (140), e57901, doi:10.3791/57901 (2018).
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