Contrasto-Matching detergente in esperimenti di Scattering di neutroni Small-Angle per Ab Initio modellazione e analisi strutturale di proteine di membrana

Summary

Questo protocollo viene illustrato come ottenere un modello a bassa risoluzione ab-initio e dettagli strutturali di una proteina di membrana detergente-solubilizzato in soluzione mediante scattering di neutroni piccolo angolo con contrasto-corrispondenza del detergente.

Abstract

Lo strumento di dispersione biologica ad angolo piccolo neutrone al High-Flux isotopo reattore di Oak Ridge National Laboratory è dedicato allo studio di materiali biologici, biocarburanti lavorazione e materiali bio-ispirato che coprono nanometro a scale di lunghezza di micrometro. I metodi presentati qui per indagare le proprietà fisiche (cioè, dimensioni e forma) delle proteine di membrana (qui, MmIAP, del intramembrane aspartil proteasi da Methanoculleus marisnigri) in soluzioni di formazione di micelle sono detergenti particolarmente adatto per questo strumento di scattering ad angolo piccolo neutrone, tra gli altri. Altre tecniche di caratterizzazione biofisica sono ostacolati dalla loro incapacità di affrontare i contributi detersivi in una struttura di complesso proteina-detergente. Accesso al laboratorio di Bio-Deuteration fornisce inoltre funzionalità uniche per la preparazione di coltivazioni su larga scala e che esprimono le proteine deuterio-etichettati per una maggiore dispersione del segnale dalla proteina. Mentre questa tecnica non fornisce dettagli strutturali in alta risoluzione, il divario di conoscenza strutturale per le proteine di membrana contiene molte zone indirizzabile di ricerca senza risoluzione vicino-atomica. Ad esempio, queste aree includono la determinazione degli Stati oligomerici, formazione complessa, cambiamenti conformazionali durante perturbazione ed eventi di chiusura/apertura. Queste indagini possono essere facilmente realizzate attraverso applicazioni di questo metodo.

Introduction

Proteine di membrana sono codificati di circa il 30% di tutti i geni¹ e rappresentano una forte maggioranza di bersagli per farmaci medicinali moderni. ² queste proteine svolgono una vasta gamma di funzioni cellulari vitali,³ ma nonostante la loro abbondanza e importanza — rappresentano solo circa l’1% del totale strutture depositato nel Research Collaboratory per bioinformatica strutturale (RCSB) proteina Banca dati. ⁴ a causa della loro natura parzialmente idrofobo, determinazione strutturale delle proteine di membrana-limita è stato estremamente impegnativo. ^{5 , 6 , 7}

Come molte tecniche biofisiche richiedono particelle monodisperse in soluzione per la misurazione, isolando le proteine di membrana dalle membrane native e queste proteine in un mimic solubile delle membrane native di stabilizzazione è stato un’area attiva di ricerca negli ultimi decenni. ^{8 , 9 , 10} queste indagini hanno portato allo sviluppo di molti romanzo anfifilici assembly per solubilizzare le proteine di membrana, come nanodiscs,^11,12,13 bicelles,^14,15 e amphipols. ^{16 , 17} tuttavia, l’uso di detergenti micelle rimane uno degli approcci più comuni e semplici per soddisfare le esigenze di solubilità di una data proteina. ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25} purtroppo, nessun singolo detersivo o la magica miscela di detergenti attualmente esiste che soddisfa tutte le proteine di membrana; così, queste condizioni devono essere schermate empiricamente per le esigenze specifiche di ogni proteina. ^{26 , 27}

Detergenti, auto-assemblarsi in soluzione sopra loro concentrazione micellare critica per formare le strutture aggregati chiamate micelle. Micelle sono composte di molti monomeri detergente (in genere che vanno da 20-200) con catene idrofobiche alchiliche formando un nucleo di micelle e gruppi testa idrofiliche disposti in uno strato di guscio micella affrontando il solvente acquoso. Il comportamento di detergenti e formazione di micelle è stato classicamente descritto da Charles Tanford in The effetto idrofobico,²⁸ e dimensioni e forme delle micelle dai detergenti comunemente utilizzati negli studi di proteine di membrana sono stati caratterizzata mediante scattering ad angolo piccolo. ^{29 , 30} organizzazione detersivo sulle proteine di membrana è stato anche studiato, e la formazione di complessi proteina-detergente (PDC) è previsto con detergente molecole circostanti la proteina in un arrangiamento che ricorda il detergente pulito micelle. ³¹

Uno ha aggiunto vantaggio nell’utilizzo di detergenti è che le proprietà di micella risultante possono essere manipolate incorporando altri detergenti. Molti detergenti per mostre di miscelazione ideale, e selezionare proprietà delle micelle miste possono anche essere prevedute dal componenti e rapporto di miscelazione. ²² tuttavia, la presenza di detersivo può ancora presentare sfide per caratterizzazioni biofisiche contribuendo al segnale complessivo. Ad esempio, con tecniche di dispersione della luce e raggi x, segnale da detersivo in PDC è praticamente indistinguibile dalla proteina. ³² le indagini con singola particella cRIO-microscopia elettronica (cryo-EM) in genere si basano su particelle intrappolate (congelate); dettagli strutturali della proteina sono ancora oscurati da taluni detersivi o un’alta concentrazione di detersivo che aggiunge allo sfondo. ³³ approcci alternativi verso interpretando la completa struttura PDC (compreso il detersivo) sono state fatte attraverso metodi computazionali che cercano di ricostruire il detersivo intorno una proteina di membrana determinato. ³⁴

Per il caso di scattering di neutroni, la disposizione di nucleo-guscio di detersivo nella micella produce un fattore di forma che contribuisce alla dispersione osservata. Fortunatamente, i componenti della soluzione possono essere alterati tale che non contribuiscono alla dispersione osservata netta. Questo processo di “contrasto di corrispondenza” si ottiene sostituendo deuterio per l’idrogeno ottenere una densità di lunghezza di dispersione che corrisponde a quello dello sfondo (buffer). Deve essere considerate una scelta giudiziosa di detergente (con controparti deuterati disponibile) e il loro rapporto di miscelazione. Per detergente micelle, questa sostituzione può essere eseguita usando un detersivo con lo stesso gruppo di testa ma avendo una catena alchilica deuterato (d-coda invece di h-coda). Dato che i detergenti sono ben miscelati,³⁵ loro aggregati avrà una densità di lunghezza di dispersione è la frazione molare ponderata medio dei due componenti (h-code e d-code). Quando questo contrasto medio è coerenza con quella del gruppo di testa, le strutture di aggregazione uniforme possono essere abbinate completamente per rimuovere tutti i contributi alla dispersione osservata.

Presentiamo qui un protocollo per manipolare il contrasto di neutroni di micelle detergente incorporando molecole chimicamente identici detersivi con catene alchiliche deuterio-etichettati. ^{19 , 36 , 37} ciò consente il completo contrasto simultaneo di corrispondenza della micella core e shell, che è una capacità unica di scattering di neutroni. ^{35 , 38} con questo significativamente raffinato livello di dettaglio, contrasto di corrispondenza può attivare studi altrimenti irrealizzabile di strutture di proteine di membrana. Inoltre, questo approccio di contrasto di corrispondenza potrebbe essere esteso ad altri sistemi che coinvolgono detergente, come polimero cambio reazioni³⁹ e olio-acqua disperdenti,⁴⁰ o anche altri agenti solubilizzanti, quali bicelles,⁴¹ nanodiscs,⁴² o blocco di copolimeri. ⁴³ A approccio simile come delineato in questo manoscritto, ma impiegando una singola specie di detersivo con sostituzioni di deuterio parziale sul gruppo alchilico catena e/o di testa, è stato recentemente pubblicato. ³⁷ mentre questo può essere previsto per migliorare la distribuzione casuale di idrogeno e deuterio in tutto il detersivo rispetto all’approccio qui presentato, il numero limitato di posti disponibili sul detersivo per sostituzione e in due fasi detergente sintesi necessari pone ulteriori sfide per l’esame.

I passaggi 1 e 2 del protocollo descritto di seguito spesso si sovrappongono poiché esperimento iniziale pianificazione deve essere fatto per presentare una proposta di qualità. Tuttavia, la presentazione delle proposte è considerato qui come il primo passo per sottolineare che questo processo deve essere iniziato in anticipo un esperimento di neutroni. Si noti inoltre che un passaggio dei prerequisiti, che dovrebbe essere dimostrato dalla proposta, è di avere la caratterizzazione biochimica e fisica (tra cui purezza e stabilità) del campione sostiene la necessità per gli studi di neutroni. Una discussione generale di small-angle neutron scattering (SANS) è oltre la portata di questo articolo. Un’introduzione breve ma completa è disponibile nella Caratterizzazione di materiali da Kaufmann,⁴⁴ e una soluzione completa di libro concentrata sul biologica small-angle scattering è stata recentemente pubblicata l’opera di riferimento. ⁴⁵ ulteriori letture consigliate sono riportate nella sezione discussione. Scattering di piccolo angolo utilizza il così chiamato vettore di dispersione Q come la quantità centrale che descrive il processo di dispersione. In questo articolo utilizza la definizione ampiamente accettata Q = 4 π sin (θ) / λ, dove θ è la metà dell’angolo tra fascio in ingresso e sparso e λ è la lunghezza d’onda della radiazione neutronica in Angstrom. Esistono altre definizioni che uso diverso simboli come di ‘ per il vettore di dispersione e che possono variare di un fattore 2 π o utilizzando nanometri al posto di Angstrom (Vedi anche la discussione di Figura 10).

Protocol

1. preparare e presentare una proposta di strumento e tempo fascio di neutroni Facility Consultare le risorse online per l’identificazione di strutture di scattering di neutroni che forniscono l’accesso di utente generale neutroni fascio tempo, come ad esempio Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Mappa di neutroni strutture e informazioni sulla ricerca di neutroni in tutto il mondo è disponibile online. 46 essere consapevoli del fatto che queste strutture sono in genere regolari inviti…

Representative Results

Una proposta di tempo e strumento di fascio chiaramente dovrebbe trasmettere tutte le informazioni necessarie per il Comitato di revisione in modo che può essere fatta una valutazione valida dell’esperimento proposto. Comunicazione con un NSS è altamente consigliata per gli utenti inesperti. il NSS può valutare fattibilità iniziale e presentazione delle proposte Guida per enfatizzare la fattibilità, la sicurezza e il potenziale per la scienza ad alto impatto. Le informazioni fornite …

Discussion

I ricercatori di biologia strutturale sfruttano tecniche strutturali complementari come soluzione dispersione per ottenere dettagli biochimici e strutturali (ad esempio, forma e dimensioni complessive) da biomolecole in soluzione. SANS è una tecnica particolarmente attraente per la determinazione di strutture di bassa risoluzione delle proteine di membrana, un focus di nucleo della moderna biologia strutturale e biochimica. SANS richiede quantità di proteine purificate paragonabili a quelli degli studi cristallografici…

Materials

Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator	EMD Millipore	UFC905096	labware
Ammonium citrate dibasic	Fisher Scientific	A663	medium component
Ammonium sulfate	EMD Millipore	2150	medium component
Bioflo 310 Bioreactor System	Eppendorf	M1287-2110	equipment
Calcium chloride dihydrate	Acros	423525000	medium component
Carbenicillin	IBI Scientific	IB02025	antibiotic
Chloramphenicol	EMD Millipore	3130	antibiotic
Cobalt (II) chloride	Acros	AC21413-0050	medium component
Copper (II) sulfate	Acros	AC19771-1000	medium component
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	756822	medium component
Drierite Gas Purifier	W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.	27068
EDTA, disodium, dihydrate	EMD Millipore	4010	medium component
Emulsiflex-C3	Avestin	EF-C3	equipment
Äkta Purifier UPC100	GE Healthcare		equipment
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	medium component
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column	GE Healthcare	17116701
Imidazole	VWR	97064-622
IPTG	Teknova	I3325
Iron(III) chloride hexahydrate	MP Biochemicals	ICN19404590	medium component
LB Agar Miller	Fisher Scientific	BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate	VWR	97062-134	medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate	Acros	AC20590-5000	medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker	Thermo Scientific	SHKE6000-7	equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside	Anatrace	D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside	Anatrace	D310A
Potassium phosphate monobasic	VWR	97062-346	medium component
RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific Sorvall	46910	equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free	Sigma-Aldrich	S8830
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	795429
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S7907	medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane	VWR	28145-501	labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane	Thermo Scientific	596-4520	labware
Superdex 200 10/300 GL	GE Healthcare	17517501
Superose-12 10/300 GL column	GE Healthcare	17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter	GE Healthcare	80211630	equipment
Zinc sulfate monohydrate	Acros	AC38980-2500	medium component