Kontrast-samsvarende vaskemiddel i liten vinkel Neutron spredning eksperimenter for membran Protein strukturell analyse og Ab Initio modellering

Summary

Denne protokollen demonstrerer hvordan å få en lav oppløsning ab initio modell og strukturelle detaljer i et vaskemiddel-solubilized membran protein i løsning med liten vinkel neutron spredning med kontrast-matching av vaskemiddel.

Abstract

Biologiske liten vinkel neutron spredning apparatet med høy-Flux isotop reaktoren i Oak Ridge National Laboratory er dedikert til etterforskningen av biologisk materiale, biodrivstoff behandling og bio-inspirert materialer dekker nanometer til mikrometer lengde skalaer. Metodene presenteres her for å undersøke fysiske egenskaper (dvs. størrelse og form) av membran proteiner (her, MmIAP, en intramembrane aspartyl protease fra Methanoculleus marisnigri) i løsninger av micelle-forming vaskemidler er velegnet for liten vinkel neutron spredning instrumentet, blant andre. Andre Biofysiske karakterisering teknikker er hindret av deres manglende evne til å løse vaskemiddel bidragene i en protein-rengjøringsmiddel kompleks struktur. Dessuten gir tilgang til Bio-deuterasjon (deuterering) Lab unike muligheter for utarbeidelse store nærområdet og uttrykke deuterium-merket proteiner for forbedret spredning signalet fra protein. Mens denne teknikken gir ikke strukturelle detaljer i høy oppløsning, strukturelle kunnskapen hullet for membran proteiner inneholder mange adresserbare områder av forskning uten nær Atom løsning. For eksempel omfatter disse områdene fastsettelse av oligomeric stater, komplekse formasjon, conformational endringer under forstyrrelsene og folding/unfolding arrangementer. Disse undersøkelsene kan lett oppnås gjennom programmer av denne metoden.

Introduction

Membran proteiner er kodet av anslagsvis 30% av alle gener¹ og representerer en sterk flertallet av mål for moderne medisinsk narkotika. ² disse proteinene utfører en rekke viktige cellulære funksjoner,³ men til tross for sine overflod og betydning, representerer bare ca 1% av totale strukturer avsatt i forskning Collaboratory for strukturelle bioinformatikk (RCSB) Protein Data Bank. ⁴ deres delvis hydrofobe naturen strukturelle fastsettelse av membran-bundet proteiner har vært meget utfordrende. ^{5 , 6 , 7}

Som mange Biofysiske teknikker krever monodisperse partikler i løsningen for måling, har isolere membran proteiner fra innfødte membraner og stabilisere disse proteinene i en løselig etterligne av innfødte membraner vært et aktivt område av forskning i siste tiår. ^{8 , 9 , 10} disse undersøkelsene har ført til utviklingen av mange romanen amphiphilic samlinger til solubilize membran proteiner, slik som nanodiscs,^11,12,13 bicelles,^14,15 og amphipols. ^{16 , 17} men bruk av vaskemiddel micelles fortsatt en av de vanligste og enkel tilnærmingene for å oppnå løselighet kravene til et bestemt protein. ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25} dessverre ingen enkelt vaskemiddel magisk blanding av vaskemidler ikke finnes eller som tilfredsstiller alle membran proteiner; Dermed må disse forholdene bli empirisk vist for de unike kravene hver protein. ^{26 , 27}

Vaskemidler montere selv i løsning over deres kritisk micelle konsentrasjon skjemaet samlede strukturer kalt micelles. Micelles består av mange vaskemiddel monomerer (vanligvis varierer fra 20-200) med hydrofobe alkyl kjeder danner en micelle kjerne og hydrofile hodet grupper ordnet i et micelle ytterlag overfor vandig løsemiddelet. Virkemåten til vaskemidler og micelle formasjon har blitt klassisk beskrevet av Charles Tanford The hydrofobe,²⁸ og størrelser og former av micelles fra vanlige vaskemidler i membranen protein studier har vært preget med liten vinkel spredning. ^{29 , 30} vaskemiddel organisasjon om membran proteiner også har vært studert, og dannelsen av protein-rengjøringsmiddel komplekser (PDC) forventes med vaskemiddel molekyler rundt protein i en ordning som ligner pen vaskemiddel micelles. ³¹

En ekstra fordel i bruker rengjøringsmidler er at de resulterende micelle egenskapene kan manipuleres ved å innlemme andre vaskemidler. Mange vaskemidler utstilling ideell blanding, og velg egenskaper av blandet micelles selv kan forutsies fra komponenter og forholdet mellom miksing. ²² men tilstedeværelsen av vaskemiddel kan fortsatt presentere utfordringer for Biofysiske karakteristikkene ved å bidra til det totale signalet. For eksempel røntgen og lysspredning teknikker er signal fra vaskemiddel i PDCEN nesten utvisket fra protein. ³² undersøkelser med enkelt-partikkel cryo-elektronmikroskop (cryo-EM) vanligvis stole på fanget (frossen) partikler; strukturelle detaljer i protein er fremdeles skjult av visse vaskemidler eller en høy konsentrasjon av vaskemiddel som legger til bakgrunnen. ³³ alternative tilnærminger mot tolke full PDC strukturen (inkludert vaskemiddel) er gjort gjennom beregningsorientert metoder som søker å rekonstruere smuss rundt et gitt membran protein. ³⁴

For tilfelle av neutron spredning produserer core-shell ordningen av vaskemiddel i micelle en formfaktor som bidrar til den observerte spredningen. Heldigvis kan løsningskomponenter endres slik at de ikke bidrar til netto observert spredning. Denne “kontrast matchende” prosessen oppnås ved å erstatte deuterium for hydrogen for å oppnå en spredning lengde tetthet som samsvarer med bakgrunnen (buffer). Et fornuftig valg av vaskemiddel (med tilgjengelig deuterated kolleger) og deres forhold blanding må vurderes. For vaskemiddel micelles, kan denne erstatningen utføres bruk et vaskemiddel med samme leder gruppen, men har en deuterated alkyl kjede (d-halen i stedet for h-tail). Siden vaskemidler er godt blandet,³⁵ sine aggregater vil ha en spredning lengde tetthet som er en føflekk-brøkdel vektet gjennomsnitt av de to komponentene (h haler og d haler). Når denne gjennomsnittlig kontrast er konsekvent med at gruppen leder, samsvarer uniform samlet strukturer fullt for å fjerne alle bidrag til observert spredning.

Vi presenterer her en protokoll for å manipulere neutron kontrasten vaskemiddel micelles ved å innlemme kjemisk identisk vaskemiddel molekyler med deuterium-merket alkyl kjeder. ^{19 , 36 , 37} Dette tillater samtidig kontrast matching av micelle kjernen og shell, som er en unik evne neutron spredningsprosent. ^{35 , 38} med denne betydelig raffinert detaljnivå, kontrast matchende kan aktivere ellers unfeasible studier membran proteinstrukturer. I tillegg kan denne kontrast som utvides til andre systemer som involverer vaskemiddel, som polymer exchange reaksjoner³⁹ og olje-vann dispergeringsmidler,⁴⁰ eller til andre solubilizing stoffer, som bicelles,⁴¹ nanodiscs,⁴² eller blokker copolymers. ⁴³ A lignende tilnærming som beskrevet i dette manuskriptet, men ansette én vaskemiddel Art med delvis deuterium erstatninger for alkyl kjede og/eller leder gruppen, ble nylig publisert. ³⁷ mens dette kan forventes å forbedre tilfeldig fordeling av hydrogen og deuterium gjennom smuss sammenlignet tilnærmingen som presenteres her, begrenset antall tilgjengelige plasseringer i vaskemiddel for substitusjon og to-trinns vaskemiddel syntese kreves positurer flere utfordringer for vurdering.

Trinn 1 og 2 av protokollen vises nedenfor ofte overlapper siden første eksperiment planlegging må gjøres for å sende inn en kvalitet forslag. Men forslaget innlevering regnes som første skritt for å understreke at denne prosessen skal startes forveien en neutron eksperiment. Det bør også bemerkes at en forutsetning, som bør bli demonstrert av forslaget, er å ha biokjemiske og fysiske karakterisering (inkludert renhet og stabilitet) av prøven støtte behovet for Nøytron studier. En generell diskusjon om liten vinkel neutron spredning (San) er utenfor omfanget av denne artikkelen. En kort, men grundig innføring er tilgjengelig i den referanse arbeidet Karakterisering av materialer av Kaufmann,⁴⁴ og en omfattende lærebok fokusert på biologiske liten vinkel løsning spredning er nylig publisert. ⁴⁵ ytterligere anbefalt lesing er gitt under diskusjon. Liten vinkel spredning bruker såkalte spredning vektoren Q som sentrale antallet som beskriver spredning. Denne artikkelen bruker allment akseptert definisjon Q = 4π synd (θ) / λ, der θ er halvparten vinkelen mellom innkommende og spredt stråle og λ er bølgelengdeområdet av neutron stråling i Ångstrøm. Andre definisjoner finnes at bruk forskjellige symboler som er “for spredning vektoren, og at avvike ved en faktor 2π eller nanometer i stedet for Angstrom (se diskusjon av Figur 10).

Protocol

1. forberede og sende en Neutron anlegget strålen tid og Instrument forslag Se elektroniske ressurser for å identifisere neutron spredning fasiliteter som gir generelt bruker neutron strålen tilgang, for eksempel Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Kart over neutron fasiliteter og informasjon om neutron forskning verdensomspennende er tilgjengelig online. 46 være oppmerksom på at disse anleggene vanligvis har vanlig utlysninger; Dette bestemmer når neste strålen gang vil være t…

Representative Results

Strålen tid og instrument forslag skal tydelig formidle all informasjon nødvendig til gjennomgangen komiteen slik at en gyldig vurdering av foreslåtte eksperimentet kan gjøres. Kommunikasjon med en NSS er svært foreslått for uerfarne brukere. NSS kan vurdere første gjennomførbarhet og guide forslag innlevering å understreke gjennomførbarhet, sikkerhet og potensialet for høy effekt vitenskap. Informasjonen i forslaget bør inkludere bakgrunnsinformasjon og kontekst for betydning…

Discussion

Strukturell biologi forskere utnytte komplementære strukturelle teknikker som løsning spredning å hente biokjemiske og strukturelle detaljer (som størrelsen og form) fra biomolecules i løsningen. SANS er en spesielt attraktivt teknikk for å bestemme lav oppløsning strukturer av membran proteiner, en kjerne fokus på moderne strukturell biologi og biokjemi. SANS krever mengder renset proteiner sammenlignbare med krystallografisk forsøk (1 mg/sampling). Nylig voksende kommersielle tilgjengeligheten av høy renhetsg…

Materials

Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator	EMD Millipore	UFC905096	labware
Ammonium citrate dibasic	Fisher Scientific	A663	medium component
Ammonium sulfate	EMD Millipore	2150	medium component
Bioflo 310 Bioreactor System	Eppendorf	M1287-2110	equipment
Calcium chloride dihydrate	Acros	423525000	medium component
Carbenicillin	IBI Scientific	IB02025	antibiotic
Chloramphenicol	EMD Millipore	3130	antibiotic
Cobalt (II) chloride	Acros	AC21413-0050	medium component
Copper (II) sulfate	Acros	AC19771-1000	medium component
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	756822	medium component
Drierite Gas Purifier	W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.	27068
EDTA, disodium, dihydrate	EMD Millipore	4010	medium component
Emulsiflex-C3	Avestin	EF-C3	equipment
Äkta Purifier UPC100	GE Healthcare		equipment
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	medium component
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column	GE Healthcare	17116701
Imidazole	VWR	97064-622
IPTG	Teknova	I3325
Iron(III) chloride hexahydrate	MP Biochemicals	ICN19404590	medium component
LB Agar Miller	Fisher Scientific	BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate	VWR	97062-134	medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate	Acros	AC20590-5000	medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker	Thermo Scientific	SHKE6000-7	equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside	Anatrace	D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside	Anatrace	D310A
Potassium phosphate monobasic	VWR	97062-346	medium component
RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific Sorvall	46910	equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free	Sigma-Aldrich	S8830
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	795429
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S7907	medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane	VWR	28145-501	labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane	Thermo Scientific	596-4520	labware
Superdex 200 10/300 GL	GE Healthcare	17517501
Superose-12 10/300 GL column	GE Healthcare	17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter	GE Healthcare	80211630	equipment
Zinc sulfate monohydrate	Acros	AC38980-2500	medium component