Kontrast-matchande tvättmedel i liten vinkel Neutron Scattering experiment för membran Protein strukturell analys och Ab Initio modellering

Summary

Detta protokoll visar hur du skaffar en lågupplöst rättsverkan modell och strukturella Detaljer för ett tvättmedel-solubilized membranprotein i lösningen med liten vinkel neutronspridning med kontrast-matchning av tvättmedel.

Abstract

Det biologiska small-angle neutron scattering instrumentet på High-Flux isotopen reaktorn av Oak Ridge National Laboratory är tillägnad utredningen av biologiska material, biobränsle bearbetning och bio-inspirerade material som täcker nanometer till mikrometer längdskalor. De metoder som presenteras här för att utreda fysiska egenskaper (dvs., storlek och form) av membranproteiner (här, MmIAP, en intermembrana aspartyl proteashämmare från Methanoculleus marisnigri) i lösningar av micelle-bilda rengöringsmedel är väl lämpad för detta liten vinkel neutron scattering instrument, bland annat. Andra biofysiska karakterisering tekniker hindras av deras oförmåga att ta itu med tvättmedel bidragen i en protein-tvättmedel komplex struktur. Dessutom ger tillgång till Bio-Deuteration Lab unika möjligheter för att förbereda storskaliga odlingar och uttrycker deuterium-märkt proteiner för förbättrad spridning signal från proteinet. Medan detta teknik ger inte strukturella Detaljer på högupplösta, strukturella kunskapsluckorna för membranproteiner innehåller många adresserbara områden av forskning utan nära-atomär upplösning. Dessa områden omfattar exempelvis bestämning av Oligomera stater, komplexa bildande, konfirmerande förändringar under störning och vikning/utspelas händelser. Dessa undersökningar kan lätt åstadkommas genom tillämpningar av denna metod.

Introduction

Membranproteiner är kodade med uppskattningsvis 30% av alla gener¹ och utgör en stark majoritet av mål för moderna läkemedel. ² dessa proteiner utför ett brett spektrum av vitala cellulära funktioner,³ men trots deras överflöd och betydelse — endast utgör cirka 1 procent av totala strukturer deponeras i forsknings Collaboratory struktur Bioinformatik (RCSB) protein Data banken. ⁴ på grund av deras delvis hydrofoba karaktären, strukturella bestämning av membran-bundna proteiner har varit oerhört utmanande. ^{5 , 6 , 7}

Eftersom många biofysiska tekniker kräver monodisperse partiklar i lösningen för mätning, har isolera membranproteiner från infödda membran och stabilisera dessa proteiner i en löslig härma av infödda membran varit ett aktivt område av forskning under de senaste årtiondena. ^{8 , 9 , 10} det undersökningarna har lett till utvecklingen av många roman amfifila församlingar till solubilize membranproteiner, såsom nanodiscs,^11,12,13 bicelles,^14,15 och amphipols. ^{16 , 17} , användning av rengöringsmedel miceller förblir dock en av de vanligaste och enkla metoderna för att tillfredsställa löslighet kraven i ett visst protein. ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25} tyvärr ingen enda tvättmedel eller magiska blandning av rengöringsmedel för närvarande finns som uppfyller alla membranproteiner; Således måste dessa villkor undersökas empiriskt för de unika kraven i varje protein. ^{26 , 27}

Rengöringsmedel montera själv i lösning över deras kritiska micelle koncentration att bilda sammanlagda strukturer kallas miceller. Miceller består av många tvättmedel monomerer (vanligtvis mellan 20-200) med hydrofoba alkyl kedjor bildar en micelle kärna och hydrofil huvud grupper ordnade i ett micelle skallager inför det vattenbaserade lösningsmedlet. Uppförandet av tvättmedel och micelle bildning klassiskt har beskrivits av Charles Tanford i Det hydrofoba effekten,²⁸ och storlekar och former av miceller från vanliga tvättmedel i membran protein studier har varit kännetecknas med liten vinkel spridning. ^{29 , 30} tvättmedel organisation om membranproteiner har också undersökts, och bildandet av protein-tvättmedel komplex (PDC) förväntas med tvättmedel molekyler kring proteinet i ett arrangemang som liknar den snyggt diskmedel miceller. ³¹

En tillsatt fördelen i att använda rengöringsmedel är att de resulterande micelle egenskaperna kan manipuleras genom att införliva andra rengöringsmedel. Många rengöringsmedel uppvisar perfekt blandning, och välj egenskaper av blandade miceller kan även förutsägas från komponenter och förhållandet mellan blandning. ²² men förekomsten av rengöringsmedel kan fortfarande presenterar utmaningar för biofysiska karakteriseringar genom att bidra till den övergripande signalen. Exempelvis med röntgen och ljusspridning tekniker är signalen från tvättmedel i PDC praktiskt taget omöjlig att skilja från protein. ³² utredningar med singel-particle kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) normalt förlitar sig på instängd (fryst) partiklar; strukturella Detaljer av proteinet är fortfarande skyms av vissa tvättmedel eller en hög koncentration av tvättmedel som läggs till i bakgrunden. ³³ alternativa metoder mot tolka full PDC-strukturen (inklusive tvättmedel) har gjorts genom beräkningsmetoder som syftar till att rekonstruera tvättmedel runt en given membranprotein. ³⁴

För fallet av neutronspridning producerar core-shell arrangemanget av tvättmedel i micelle en formfaktor som bidrar till den observerade spridningen. Lyckligtvis kan komponenter ändras så att de inte bidrar till netto observerade spridningen. ”Kontrast matchande” processen uppnås genom att ersätta deuterium för vätgas att uppnå en scattering längd täthet som matchar bakgrunden (buffert). Ett klokt val av tvättmedel (med tillgängliga deutererade motsvarigheter) och deras förhållande av blandning måste beaktas. För tvättmedel miceller, kan denna substitution utföras med ett rengöringsmedel med samma huvud grupp men har en deutererade alkyl kedja (d-svans i stället för h-tail). Eftersom tvätt är väl blandade,³⁵ deras aggregat har en spridning längd täthet som är den mole-fraktionen vägt genomsnitt av de två komponenterna (h-svansar och d-tails). När denna genomsnittliga kontrast är konsistent med gruppen huvud, kan de enhetliga sammanlagda strukturerna matchas helt för att ta bort alla bidrag till observerade spridning.

Vi presenterar här ett protokoll för att manipulera tvättmedel miceller neutron kontrast genom att införliva kemiskt identiska tvättmedel molekyler med deuterium-märkt alkyl kedjor. ^{19 , 36 , 37} Detta möjliggör komplett samtidig kontrast matchning av micelle kärna och skal, som är en unik funktion av neutronspridning. ^{35 , 38} med denna betydligt raffinerade detaljnivå, kontrast matchande kan aktivera annars omöjligt studier av protein membranstrukturer. Dessutom skulle denna kontrast-matchande strategi kunna utvidgas till andra system med rengöringsmedel, såsom polymer exchange reaktioner³⁹ och olja-vatten dispergeringsmedel,⁴⁰ eller även andra solubilizing medel, såsom bicelles,⁴¹ nanodiscs,⁴² eller block sampolymerer. ⁴³ A liknande tillvägagångssätt som beskrivs i detta manuskript, men sysselsätter en enda tvättmedel art med partiell deuterium substitutioner på alkyl kedja eller huvud grupp, publicerades nyligen. ³⁷ även om detta kan förväntas förbättra den slumpmässiga fördelningen av väte och deuterium i hela tvättmedel jämfört med den strategi som presenteras här, det begränsade antalet tillgängliga positioner på tvättmedel för substitution och tvåstegsverifiering rengöringsmedel syntes krävs poser ytterligare utmaningar för bedömningen.

Steg 1 och 2 i protokollet beskrivs nedan ofta överlappar varandra eftersom första försöket planering måste göras för att lägga fram ett förslag om kvalitet. Förslaget inlämning anses dock här som det första steget att betona att denna process bör inledas i god tid före en neutron experiment. Det bör också noteras att ett nödvändigt steg, som ska styrkas med förslaget, är att ha biokemiska och fysikaliska karakterisering (inklusive renhet och stabilitet) av provet stödja behovet av neutron studier. En allmän diskussion av små-vinkel neutron scattering (SANS) är utanför ramen för denna artikel. En kort men grundlig introduktion finns i referensunderlag Karakterisering av material av Kaufmann,⁴⁴ och en heltäckande lärobok fokuserade på biologiska small-angle lösning spridning har nyligen publicerats. ⁴⁵ vidare Rekommenderad läsning ges i avsnittet diskussion. Liten vinkel scattering använder så kallade scattering vektorn Q som den centrala kvantitet som beskriver spridningen. Denna artikel använder allmänt accepterade definitionen Q = 4π synd (θ) / λ, där θ är halva vinkeln mellan inkommande och spridda balk och λ är våglängden av neutronstrålning i Ångström. Andra definitioner finns att använda olika symboler såsom ‘s’ för spridning vektorn, och att skilja med en faktor 2π eller nanometer i stället för Ångström (se också diskussionen av figur 10).

Protocol

1. förbereda och lämna in en Neutron anläggning Beam tid och Instrument förslag Konsultera online-resurser för att identifiera neutron scattering faciliteter som tillhandahåller allmänna neutron beam tid användaråtkomst, såsom Oak Ridge National Laboratory (ORNL). En karta över neutron faciliteter och information om neutron forskning över hela världen är tillgänglig online. 46 vara medveten om att dessa anläggningar normalt har regelbunden förslagsinfordringar. Detta avg…

Representative Results

Beam tid och instrumentet förslag bör tydligt förmedla all information som behövs till utskottet för granskning så att en giltig bedömning av det föreslagna experimentet kan göras. Kommunikation med en NSS är bäst för oerfarna användare. NSS kan bedöma inledande genomförbarhet och guide förslag inlämning att betona genomförbarhet, säkerhet och risken för stor genomslagskraft vetenskap. Informationen i förslaget bör omfatta bakgrundsinformation och sammanhang för bet…

Discussion

Strukturbiologi forskare dra nytta av kompletterande strukturella metoder såsom lösning scattering få biokemiska och strukturella detaljer (t.ex. övergripande storleken och formen) från biomolekyler i lösning. SANS är en särskilt attraktiv teknik för bestämning av membranproteiner strukturer på låg upplösning, en kärna fokus modern strukturell biologi och biokemi. SANS kräver mängder renade proteiner jämförbara med kristallografiska studier (1 mg/prov). Den nyligen växande kommersiella tillgången av h…

Materials

Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator	EMD Millipore	UFC905096	labware
Ammonium citrate dibasic	Fisher Scientific	A663	medium component
Ammonium sulfate	EMD Millipore	2150	medium component
Bioflo 310 Bioreactor System	Eppendorf	M1287-2110	equipment
Calcium chloride dihydrate	Acros	423525000	medium component
Carbenicillin	IBI Scientific	IB02025	antibiotic
Chloramphenicol	EMD Millipore	3130	antibiotic
Cobalt (II) chloride	Acros	AC21413-0050	medium component
Copper (II) sulfate	Acros	AC19771-1000	medium component
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	756822	medium component
Drierite Gas Purifier	W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.	27068
EDTA, disodium, dihydrate	EMD Millipore	4010	medium component
Emulsiflex-C3	Avestin	EF-C3	equipment
Äkta Purifier UPC100	GE Healthcare		equipment
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	medium component
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column	GE Healthcare	17116701
Imidazole	VWR	97064-622
IPTG	Teknova	I3325
Iron(III) chloride hexahydrate	MP Biochemicals	ICN19404590	medium component
LB Agar Miller	Fisher Scientific	BP1425-2
Magnesium sulfate heptahydrate	VWR	97062-134	medium component
Manganese(II) sulfate monohydrate	Acros	AC20590-5000	medium component
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker	Thermo Scientific	SHKE6000-7	equipment
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside	Anatrace	D310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside	Anatrace	D310A
Potassium phosphate monobasic	VWR	97062-346	medium component
RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific Sorvall	46910	equipment
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free	Sigma-Aldrich	S8830
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	795429
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S7907	medium component
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane	VWR	28145-501	labware
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane	Thermo Scientific	596-4520	labware
Superdex 200 10/300 GL	GE Healthcare	17517501
Superose-12 10/300 GL column	GE Healthcare	17517301
Ultrospec 10 Cell Density Meter	GE Healthcare	80211630	equipment
Zinc sulfate monohydrate	Acros	AC38980-2500	medium component