פרוטוקול נתיישב לסינתזה של הרכבה עצמית מבוסס פוליאמין פפטיד חומרים פעילי שטח (PPAs), Biomaterials קשורים
Summary
הסינתזה של חומרים פעילי שטח פפטיד מבוססי פוליאמין (PPAs) הוא אתגר משמעותי בשל נוכחותם של nitrogens אמין מרובים, אשר דורשת שימוש מושכל של הגנה על קבוצות כדי להסוות את תגובתי פונקציות אלה. בנייר זה, אנו מתארים שיטה נתיישב עבור הכנת אלה סוג חדש של מולקולות וההספק עצמית.
Abstract
פוליאמין מבוססי חומרים פעילי פפטיד שטח (PPAs) הם סוג חדש של עצמי וההספק amphiphilic biomaterials קשורים חומרים פעילי שטח פפטיד (PAs). PAs מסורתיים בעלי חומצות אמינו טעונות כמו solubilizing קבוצות (ליזין, ארגינין), אשר מחובר ישירות ל קטע השומנים או יכול להכיל אזור מקשר גרם של חומצות אמינו נייטרלי. כוונון פפטיד רצף PAs יכולות להניב מורפולוגיות מגוונות. באופן דומה, PPAs בעלי מקטע הידרופובי וחומצות אמינו נייטרלי, אבל גם מכילים מולקולות פוליאמין כמים solubilizing קבוצות (הידרופילית). כמו במקרה עם PAs, PPAs יכול גם להתחבר בעצמם לתוך מורפולוגיות מגוונים, כולל מוטות קטנים, מעוות ננו-סרטים של מאוחה ננו-גליונות, כאשר מומס במים. עם זאת, הנוכחות של ראשי ומשני אמינים על מולקולה בודדת פוליאמין מציב אתגר משמעותי כאשר סינתזה PPAs. בנייר זה, אנו מראים פרוטוקול פשוט, מבוסס על תקדימים ספרות, כדי להשיג נתיישב סינתזה של PPAs באמצעות סינתזה פפטיד מעבדתי (SPPS). פרוטוקול זה ניתן להרחיב את הסינתזה של PAs ומערכות דומות אחרות. אנחנו גם ממחישים את השלבים הנדרשים עבור ביקוע חלבונים מן שרף, זיהוי, טיהור.
Introduction
פפטיד עצמית וההספק חומרים פעילי שטח (PAs) הם סוג של biomaterials מורכבת בדרך כלל המקטעים הבאים: בראש הידרופיליות (א), (ב) מקשר אזור, וזנב הידרופובי (ג). רוב PAs המתוארים בספרות בעלי ראש הידרופילית המורכבת של חומצת אמינו טעונות או קוטבי משקעים1,2,3,4. PAs מצאו מגוון רחב של יישומים של וההתערבות כולל משלוח סמים, אבחון מחלות, רפואה רגנרטיבית ועוד5. מבוסס על רצף חומצות אמיניות שלהם, PAs יכולים ליצור מגוון רחב של nanostructures כולל הקזאין כדורית, ננו-חוטים. לאחרונה דיווחנו מחלקה של היברידית פפטיד מבוססי פוליאמין חומרים פעילי שטח, כינה PPAs6. מורפולוגיות, קינטיקה וההספק עצמית, והשפלה מטבולית, של אלה biomaterials, נמצאו להיות קשורה קבוצת ראש solubilizing שלהם. יתר על כן, nanostructures PPA לא הראה רעילות לכיוון בתרבית של תאים (קווים MiaPaCa2 ותא הלה) בריכוזים שנבדקו. Nanocarriers מבוסס-PPA הם סמים אטרקטיבי-מסירה רכב כי: (1) פוליאמין ספיגת ואת חילוף החומרים הוכח להיות מוגברת של תאים סרטניים, nanostructures (2) cationic יכול להשיג endosomal לברוח7,8, מה שמוביל גבוה במחזור ומגורים בתוך תא, ו- (3) הם צריכים לקבל פרופיל מטבולי ייחודי בהשוואה הרשות הפלסטינית; לדוגמה, הם יהיו יציבים יותר לכיוון פרוטאזות נמצא בגוף האדם (למרות שהם רגישים אולי אנזימים אחרים, כגון amine oxidases)9,10. כמו כן, PPAs נמצאו מורפולוגיות מגוונים, מאפיינים physicochemical, ננו-חלקיק נוקשות, ואת מכלול קינטיקה בהתאם לאורך ואת תשלום של PPA בודדים מולקולה6. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט עבור סינתזה, זיהוי, טיהור של PPAs כי ניתן להחיל גם על הכנת PAs או מולקולות דומות של פפטיד היברידית.
כיוון polyamines כלל אינם זמינים מסחרית בצורות שלהם מוגן, וכיוון הגנה אמינים הראשיים והמשניים של polyamines הוא בעל חשיבות עליונה עבור conjugating אותם עם חומצות אמינו ומולקולות אחרות, אנחנו המחולקות שלבים סינתטיים כדי להשיג את ההגנה שלהם. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה נועד לספק שיטה פשוטה עבור conjugating polyamines כדי חומצות אמינו. Polyamines חוסר קבוצה קרבוקסילית; לפיכך, הם לא מצמידים רינק אמיד או שרפים וואנג. במקום זאת, שרפים כגון 2-chlorotrityl כלוריד מומלצים עבור פרוטוקול סינתטי. האתגר העיקרי לטיפוסי PPA סינתזה היא הנוכחות של קבוצות פונקציונליות אמין יסודי ותיכון. למטרות שלנו, הגנו כל אמינים משניים ב פוליאמין תוך שמירה על קבוצה אמינו העיקרי על פוליאמין בחינם לאפשר צימוד הריאקציה. התגובה נעשה על תמיכה מלאה בעקבות עקרונות מעבדתי פפטיד סינתזה (SPPS) כדי להקל את העבודה לאחר כל שלב צימוד ו- deprotection. הפרוטוקול הבא מיועד הן ידניים ואוטומטיים הסינתזה של PPAs (למרות שאימות כמה צעדים יתחרו בבמערכת אוטומטית). הסינתזה של מולקולות אלה ניתן גם לבצע בחוץ של סינתיסייזר אוטומטיות או בסיועם של כור מיקרוגל (אוטומטית או חצי אוטומטית). יש כבר סיכם את ערכת התגובה באיור1.
איור 1: (א) A סכימת התגובה הכללית לסינתזה של PPAs. Polyamines נציג (B) שניתן להתרגל מסונתז PPAs המתוארים כאן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקולים המתוארים כאן ניתן לסנתז PPAs כמו בארות כמו PAs, הקשורות מבוססת על פפטיד מולקולות (כמו היברידי PA-peptoids). למרות הסינתזה של פפטידים באמצעות SPPS היא תהליך פשוט, הסינתזה של פפטידים המכילים מולקולות ביולוגיות ביות יכולה להיות מאתגרת במיוחד. Polyamines כמו spermine, spermidine, diethyelenetriamine, וכו, יכול ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפרויקט מומן על ידי והמרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה (סטארט-אפ קרנות, MC-S); NIH COBRE, 5P20GM103480 (Bronich ט) של האגודה האמריקנית לכימיה, PRF # 57434-DNI7(MC-S).
Materials
| 2-Chlorotrityl chloride resin | AappTec | RTZ001 | |
| SynthwareTM synthesis vessel | Aldrich | SYNP120050M | |
| Dichloromethane | Acros | AC406920250 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Wrist Shaker | Boekel Scientific | 401000-2 | |
| Kaiser test kit | Sigma-Aldrich | 60017 | |
| 2-[(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl-amino]-ethanol | Sigma-Aldrich | CDS004772 | |
| Anhydrous Methanol | Acros | AC610981000 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Chloranil test kit | TCI | TCC1771-KIT | VWR Catalogue # |
| Di-tert butyl di-carbonate | Acros | AC194670250 | Fisher Sci. Catalogue # |
| Dimethylformamide | Fisher Scientific | BP1160-4 | |
| Hydrazine | Acros | AC296815000 | FIsher Sci. Catalogue # |
| (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate) | p3biosystems | 31001 | |
| 4-methyl piperidine | Acros | AC127515000 | FIsher Sci. Catalogue # |
| Trifluoroacetic Acid | AappTec | CXZ035 | |
| Triisopropyl Silane | Sigma-Aldrich | 233781 | |
| Ether | Fisher Scientific | E138-1 | |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| 9-Aminoacridine | Sigma-Aldrich | 92817 | |
| Fisherbrand Syringe Filters: PTFE Membrane | Fisher Scientific | 09-730-21 |
References
- Cui, H., Pashuck, E. T., Velichko, Y. S., Weigand, S. J., Cheetham, A. G., Newcomb, C. J., Stupp, S. I. Spontaneous and x-ray-triggered crystallization at long range in self-assembling filament networks. Science. 327, 555-559 (2010).
- Pashuck, E. T., Cui, H., Stupp, S. I. Tuning supramolecular rigidity of peptide fibers through molecular structure. Journal of the American Chemical Society. 132, 6041-6046 (2010).
- Stupp, S. I., Zha, R. H., Palmer, L. C., Cui, H., Bitton, R. Self-assembly of biomolecular soft matter. Faraday Discussions. 166, 9-30 (2013).
- Conda-Sheridan, M., Lee, S. S., Preslar, A. T., Stupp, S. I. Esterase-activated release of naproxen from supramolecular nanofibres. Chemical Communications. 50, 13757-13760 (2014).
- Mata, A., Palmer, L., Tejeda-Montes, E., Stupp, S. I. Design of biomolecules for nanoengineered biomaterials for regenerative medicine. Nanotechnology in Regenerative Medicine. , 39-49 (2012).
- Samad, M. B., Chhonker, Y. S., Contreras, J. I., McCarthy, A., McClanahan, M. M., Murry, D. J., Conda-Sheridan, M. Developing Polyamine-Based Peptide Amphiphiles with Tunable Morphology and Physicochemical Properties. Macromolecular bioscience. 17, (2017).
- Nel, A. E., Mädler, L., Velegol, D., Xia, T., Hoek, E. M., Somasundaran, P., Klaessig, F., Castranova, V., Thompson, M. Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface. Nature Materials. 8, 543 (2009).
- Gujrati, M., Malamas, A., Shin, T., Jin, E., Sun, Y., Lu, Z. -. R. Multifunctional cationic lipid-based nanoparticles facilitate endosomal escape and reduction-triggered cytosolic siRNA release. Molecular Pharmaceutics. 11, 2734-2744 (2014).
- Zhu, Y., Li, J., Kanvinde, S., Lin, Z., Hazeldine, S., Singh, R. K., Oupický, D. Self-immolative polycations as gene delivery vectors and prodrugs targeting polyamine metabolism in cancer. Molecular Pharmaceutics. 12, 332-341 (2014).
- Planas-Portell, J., Gallart, M., Tiburcio, A. F., Altabella, T. Copper-containing amine oxidases contribute to terminal polyamine oxidation in peroxisomes and apoplast of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 13, 109 (2013).
- Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. Dde – A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates. Tetrahedron Letters. 37, 2625-2628 (1996).
- Ralhan, K., KrishnaKumar, V. G., Gupta, S. Piperazine and DBU: a safer alternative for rapid and efficient Fmoc deprotection in solid phase peptide synthesis. RSC Advances. 5, 104417-104425 (2015).
- Casero, R. A., Marton, L. J. Targeting polyamine metabolism and function in cancer and other hyperproliferative diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 6, 373 (2007).
- Wuts, P. G. M., Greene, T. W. . Protection for the Amino Group. In Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis. , 696-926 (2006).
- Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. Journal of Peptide Science. 13, 143-148 (2007).
