Una piattaforma di Microphysiologic per grasso umano: Sandwich tessuto adiposo bianco
Summary
Tessuto adiposo bianco (WAT) ha gravi lacune nei suoi modelli di cultura primaria corrente, ostacolando lo sviluppo farmacologico e gli studi metabolici. Qui, presentiamo un protocollo per produrre un sistema adiposo microphysiological di WAT sandwiching tra fogli di cellule stromali. Questo costrutto fornisce una piattaforma stabile e adattabile per colture primarie di WAT.
Abstract
Tessuto adiposo bianco (WAT) svolge un ruolo cruciale nella regolazione della salute peso e tutti i giorni. Ancora, esistono limitazioni significative ai modelli disponibili colture primarie, i quali hanno fallito fedelmente ricapitolare il microambiente adiposo o estendere la vitalità WAT oltre due settimane. La mancanza di un modello affidabile coltura primaria ostacola gravemente ricerca nel WAT metabolismo e lo sviluppo di farmaci. A tal fine abbiamo utilizzato gli standard di NIH di un sistema di microphysiologic per sviluppare una nuova piattaforma per coltura primaria WAT chiamato ‘SWAT’ (Sandwich tessuto adiposo bianco). Superiamo la galleggiabilità naturale degli adipociti di interposizione macinate WAT cluster tra fogli di adiposo-ha derivato le cellule stromal. In questo costrutto, campioni WAT sono vitali oltre otto settimane nella cultura. SWAT mantiene l’ECM intatto, contatti cellula-cellula e pressioni fisiche delle condizioni in vivo WAT; Inoltre, SWAT mantiene un robusto profilo trascrizionale, sensibilità ai segnali chimici esogeni e funzione del tessuto intero. SWAT rappresenta un metodo semplice, riproducibile ed efficace della cultura adiposo primario. Potenzialmente, è una piattaforma ampiamente applicabile per la ricerca in fisiologia, fisiopatologia, metabolismo e sviluppo farmaceutico WAT.
Introduction
Il tessuto adiposo è l’organo primario dell’obesità, che trasporta annuali costi medici diretti tra $ 147 miliardi e $ 210 miliardi a US1. L’accumulo di tessuto adiposo contribuisce anche ad altre cause conducenti della morte come malattie cardiache, diabete di tipo II e alcuni tipi di cancro2. Modelli di coltura in vitro sono essenziali per gli studi metabolici e lo sviluppo di farmaci, ma i modelli attuali di ricerca di tessuto adiposo hanno carenze principali. Adipociti sono fragile, capace di galleggiare e cellule che non aderiranno alla plastica di coltura delle cellule e pertanto non possono essere coltivate utilizzando metodi di coltura cellulare convenzionale terminalmente differenziano. Dal 1970, diversi metodi sono stati utilizzati nei tentativi di superare queste barriere, compreso l’uso di vetrini coprioggetti, soffitto cultura, coltura di sospensione e matrici extracellulari3,4,5, 6 , 7. Tuttavia, questi metodi sono stati segnati da cellule morte e dedifferenziazione e vengono in genere utilizzati per non più di un periodo di studio di due settimane. Inoltre, questi modelli non tentare ricapitolare il microambiente adiposo nativo come non mantengono intatto ECM, le interazioni tra adipociti e stromal cellule di supporto, né le cellule contrattili forze esercitano sulla vicenda in in vivo WAT.
In assenza di un metodo di cultura adiposa primaria oro-standard, ricerca adiposa si affida principalmente differenziati pre-adipociti (diffAds). DiffAds sono multilocular, aderente e metabolicamente attivo. Al contrario, primari adipociti bianchi sono unilocular, nonadherent e dimostrano relativamente basso metabolismo. Il fallimento degli attuali modelli di cultura adiposa di ricapitolare la fisiologia del tessuto adiposo maturo sano è probabilmente un fattore importante in assenza di farmaci approvati dalla FDA che incidono direttamente adipocytes. Infatti, la mancanza di modelli di organo fisiologico in vitro è un grave problema in tutta la maggior parte dei organi e malattia.
Nel suo documento di posizione che annuncia la creazione del suo programma di Microphysiological Systems (MPS), il National Institutes of Health (NIH) ha riferito che il tasso di successo 2013 attraverso tutti gli studi clinici farmaceutici umani era solo 18% per la fase II e 50% per la fase III studi clinici8. Il programma MPS è progettato per affrontare direttamente l’incapacità di monocoltura in vitro di fisiologia umana modello. Il NIH definisce MPSs come sistemi di coltura composto umano primario o cellule staminali in costrutti 3D multicellulari che ricapitolano il funzionamento dell’organo. A differenza dei modelli riduzionisti di colture cellulari immortalizzate, omogenea, MPSs dovrebbe modellano accuratamente cellula-cellula, cellula farmaco, farmaco-farmaco e organo-droga interazioni9. A differenza dei metodi di coltura primaria a breve termine, NIH standard impongono sostenibilità MPS per 4 settimane in cultura8. Ulteriori dettagli del programma MPS possono essere trovati alla RFAs (#RFA-TR-18-001)10 di NIH.
Abbiamo sviluppato un semplice, romanzo, adattabile, e poco costoso MPS adiposo definito “Sandwich tessuto adiposo bianco” (SWAT)11. Superiamo la galleggiabilità naturale degli adipociti di “sandwiching” macinato primario del tessuto adiposo tra fogli di adiposo-ha derivato le cellule stromale (CSTA) (Figura 1). Il costrutto 3D risultante ricapitola il contatto cellula-cellula e il microambiente adiposo nativo circondando adipocytes maturi con una popolazione di cellule di supporto del adipocyte naturale. SWAT è stato convalidato da dimostrare 8-settimana sostenibilità, risposta alla segnalazione esogeno, secrezione di adipokine e attecchimento in un modello animale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo dettaglia l’uso di CSTA panino la maggior parte del tessuto adiposo umano bianco; linee cellulari umane di ADSC possono essere isolate tramite protocolli ben stabiliti15. Tuttavia, il sistema può essere adattato per esigenze di ricerca individualizzata (ad esempio utilizzando cellule di 3T3L-1 al mouse panino WAT). Questo processo comporta la manipolazione del tessuto umano primario. Precauzioni di sicurezza standard dovrebbero essere impiegati; gestire tessuti umani come agenti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori si desidera ringraziare il supporto istituzionale fornito da LSU Health Sciences Center, che ha finanziato il progetto.
Materials
| 10x HBSS | Thermofisher | 14185052 | |
| Gelatin | Sigma-aldrich | G9391 | |
| Collagenase | Sigma-aldrich | C5138 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995065 | |
| M199 Media | Thermofisher | 11043023 | Phenol red-free |
| 250µm Mesh Filter | Pierce | 87791 | |
| 0.2µm Syringe Filter | Celltreat | 229747 | |
| 5mL Luer-Lok syringes | BD | 309646 | |
| Metal Washers | These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3g | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Equipment | |||
| Incubated Orbital Shaker | VWR | 10020-988 | Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion |
| Heat Block | Set to 37-40°C and placed under Biosafety Cabinet | ||
| Water Bath | Set to ~75°C | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specialized Plastics | |||
| Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell | Nunc | 174902 or 174901 | These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6cm for 6cm dish, <3.5cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6cm dish, 5.1g for 6-well plate |
| Plastic Plunger Apparatus | These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics |
References
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