Summary

Tecido-específica miRNA Expression Profiling Mouse coração seções usando em hibridação in Situ

Published: September 15, 2018
doi:

Summary

micro-RNAs (miRNAs) são sequências de RNA curtas e altamente homólogas, servindo como reguladores pós-transcricional de RNAs mensageiro (mRNAs). Métodos de deteção de miRNA atuais variam em sensibilidade e especificidade. Descreveremos um protocolo que combina a hibridação in situ e imunocoloração para a deteção simultânea de moléculas miRNA e proteína em cortes de tecido de coração de rato.

Abstract

micro-RNAs (miRNAs) são transcrições de single-stranded RNA que se ligam ao RNA mensageiro (mRNAs) e inibem a sua tradução ou promovem a sua degradação. Até à data, os miRNAs têm sido implicados em um grande número de processos biológicos e doença, que tem representado a necessidade para os métodos de detecção confiável de miRNA transcrições. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para Digoxigenina-rotulado (escavação) trancado ácido nucleico (LNA) baseada em investigação miRNA deteção, combinada com proteína immunostaining em seções de coração de rato. Primeiro, realizamos uma técnica hibridização em situ utilizando a sonda para identificar miRNA-182 expressão nas seções de coração de controle e os ratos de hipertrofia cardíaca. Em seguida, realizamos imunocoloração para proteína cardíaca de troponina T (miocardite), sobre as mesmas seções, co localizar miRNA-182 com as células de casos. Usando este protocolo, fomos capazes de detectar miRNA-182 através uma fosfatase alcalina baseado ensaio colorimetric e miocardite através de coloração fluorescente. Este protocolo pode ser usado para detectar a expressão de qualquer miRNA de interesse através das sondas LNA escavar-etiquetadas e expressão de proteínas relevantes em cortes de tecido de coração de rato.

Introduction

micro-RNAs (miRNAs) são curtas (18-25 nucleotides), RNAs single-stranded, não codificante que funcionam como reguladores negativos da expressão génica a nível pós-transcricional por inibição da tradução do RNA mensageiro (mRNA) e/ou promover a degradação do mRNA 1. os miRNAs são transcritas de intrões ou exões de codificação ou não-codificante genes e são clivadas no núcleo por DROSHA, que os miRNAs precursor (pre-miRNAs), que são estruturas de Hairpin loop curto de 70 nucleotídeos2. Seguindo citoplasmática de exportação, pré-miRNAs são subsequentemente transformados por DICER em miRNAs maduros que abrangem 18-25 nucleotides3,4. Posteriormente, o complexo silencioso induzido por RNA (RISC) incorpora estes miRNAs como single-stranded RNA, que permite a sua ligação à 3′ untranslated região (3′-UTR) dos seus mRNAs alvo para suprimir sua expressão3,5 .

Dentro nas últimas três décadas, desde que eles foram primeiramente identificados, miRNAs surgiram para mestre reguladores da expressão do gene, cujos níveis de expressão são rigidamente controlada6. Funções para os miRNAs têm sido descritas em órgão desenvolvimento7,8,9,10,11,12, manutenção da homeostase13,14 , bem como os contextos de doença que incluem neurológico15,16,17,18,19, cardiovascular20, doenças auto-imunes21 ,22, cancros23,24e outros25. A crescente valorização para a relevância de padrões de expressão de miRNA apresentou a necessidade de métodos de deteção confiável de miRNA transcrições. Tais métodos incluem PCR em tempo Real, microarrays, mancha do Norte, hibridação in situ e outros, que variam de sensibilidade, especificidade e poder quantitativa, predominantemente, devido ao fato de que miRNA transcrições são compostas de curto e sequências homólogas altamente6.

Recentemente, informou um papel importante no desenvolvimento da hipertrofia miocárdica26, uma condição descrevendo a adaptação estrutural do coração em resposta às elevadas exigências hemodinâmica27,28de miRNA-182. Hipertrofia cardíaca é caracterizada pelo aumento da massa miocárdica, que, se associado com remodelação mal-adaptativos29, pode levar a aumento do risco de insuficiência cardíaca, uma condição de contabilização de 8,5% de todas as mortes atribuíveis a cardiovascular doença de30.

Aqui, descrevemos nosso protocolo que combina a hibridação in situ com uma sonda de ácido nucleico de bloqueado (escavação) (LNA) Digoxigenina-etiquetadas e imunocoloração para a detecção simultânea de moléculas miRNA e proteína em cortes de tecido de coração de rato, em nosso modelo de hipertrofia cardíaca.

Protocol

As amostras de tecido do coração de rato para este estudo foram obtidas em conformidade com a legislação e as normas institucionais e foram aprovadas pelo Comitê de uso e Yale University institucional Cuidado Animal. 1. preparação da solução Preparar O RNase livre ddH2, tratando de 5 L de DDQ2O com 5 mL de diethylpyrocarbonate de 0,1% (DEPC) durante a noite (O/N), à temperatura ambiente (RT). Autoclave (121 ° C) para desactivar o DEPC. Uso tratada com…

Representative Results

hibridação de miRNA in situ foi otimizada em seções de coração de rato usando um scramble miRNA e U6-snRNA, que serviu como controles positivos e negativos, respectivamente. Coloração positiva é indicada em azul, enquanto a coloração negativa é indicada pela falta de desenvolvimento de cor (figura 1A-1B). Casos específico expressão de miRNA-182 foi avaliada em seções de coração de controle e PlGF superexpressão rat…

Discussion

deteção de transcrição de miRNA pode ser conseguida através de técnicas diferentes que variam em sensibilidade, especificidade e poder quantitativa. Aqui, demonstramos o acoplamento de miRNA hibridação in situ com imunocoloração e descrever um protocolo que permite a avaliação simultânea dos níveis de expressão de moléculas miRNA e proteína, sobre as mesmas seções de coração. Nós primeiro mostrar como realizar a hibridação in situ de sondas de miRNA LNA escavar-etiquetadas em se?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer Athanasios Papangelis, comentários críticos sobre o manuscrito. FM é apoiado pela biotecnologia e Conselho de pesquisa de ciências biológicas (BBSRC; BB/M009424/1). IP é suportado pela Associação coração americano cientista desenvolvimento Grant (17SDG33060002).

Materials

Diethylpyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 DEPC
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417 PBS
Tween-20 American Bioanalytical AB02038 non-ionic surfactant
Histoclear National Diagnostics HS-200
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Sigma Aldrich 3115879001 ProK
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 PFA
Sodium Chloride ThermoFisher S271 NaCl
Magnesium Chloride Hexahydrate ThermoFisher M33 MgCl2
Tris Sigma Aldrich T6066
Hydrochloric Acid Solution, 1 N ThermoFisher SA48 HCl
Hydrochloric Acid Solution, 12 N ThermoFisher S25358 HCl
1-Methylimidazole Sigma Aldrich 336092
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich 39391 EDC
Hydrogen peroxide solution H2O2 Sigma Aldrich 216763 H2O2
Trisodium citrate dihydrate Sigma Aldrich S1804 Sodium Citrate
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) Qiagen 339450 scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe QIagen YD00615701 5'-DIG and 3'-DIG labelled
Levamisol hydrochloride Sigma Aldrich 31742
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647 BSA
NBT/BCIP Tablets Sigma Aldrich 11697471001 NBT-BCIP
Potassium Chloride ThermoFisher P217 KCl
DAPI solution (1mg/ml) ThermoFisher 62248 DAPI
Glass coverslip ThermoFisher 12-545E Glass coverslip
Plastic coverslip Grace Bio-Labs HS40 22mmX40mmX0.25mm RNA-ase free plastic coverslip
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma Aldrich 11093274910 DIG antibody
Hydrophobic barrier pen Vector Laboratories H-4000 Pap pen
Anti-Cardiac Troponin T antibody Abcam ab92546 cTnT antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 ThermoFisher A-11011 anti-rabbit-568 antibody
Dako Fluorescence Mounting Medium DAKO S3023 mounting medium
Sheep serum Sigma Aldrich S3772
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Deionized Formamide American Bioanalytical AB00600
Hybridization Oven ThermoFisher UVP HB-1000 Hybridizer

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Cite This Article
Memi, F., Tirziu, D., Papangeli, I. Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (139), e57920, doi:10.3791/57920 (2018).

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