Vävnadsspecifika miRNA uttryck profilering i mus hjärtat sektioner med In Situ -hybridisering
Summary
Micro-RNAs (Mirna) är kort och mycket homologa RNA sekvenser, tjänstgör som post-transcriptional regulatorer av messenger RNA (mRNA). Nuvarande metoder för detektion av miRNA varierar i sensitivitet och specificitet. Vi beskriver ett protokoll som kombinerar i situ hybridisering och immunfärgning för samtidiga upptäckt av miRNA och protein molekyler på mus hjärtat vävnadssnitt.
Abstract
Micro-RNAs (Mirna) är enkelsträngat RNA avskrifter som binder till messenger RNA (mRNA) och hämmar deras översättning eller främja deras nedbrytning. Hittills har MicroRNA varit inblandade i ett stort antal biologiska och sjukdom processer, som signalerat behovet av tillförlitlig upptäckt metoder för miRNA avskrifter. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för digoxigenin-märkt (DIG) låst nukleinsyra (LNA) sond-baserade miRNA detektering, kombinerat med protein immunfärgning på mus hjärtat delar. Det första utfört vi en i situ hybridisering teknik använder sonden för att identifiera miRNA-182 uttryck i hjärtat sektioner från kontroll och hjärthypertrofi möss. Nästa, vi utfört immunfärgning för hjärt Troponin T (cTnT) protein, på samma avsnitt, att samtidig lokalisera miRNA-182 med hjärtmuskelcellen celler. Använder det här protokollet, kunde vi upptäcka miRNA-182 genom ett alkaliskt fosfatas baserat kolorimetriska analys och cTnT genom fluorescerande färgning. Detta protokoll kan användas för att detektera uttryck för någon miRNA av intresse genom gräva-märkt LNA sonder, och relevanta proteinuttryck på mus hjärtat vävnadssnitt.
Introduction
Micro-RNAs (Mirna) är kort (18 – 25 nukleotider), enkelsträngat, icke-kodande RNAs som fungerar som negativa regulatorer av genuttryck på post-transcriptional nivå genom att hämma budbärar-RNA (mRNA) översättning och/eller främja mRNA nedbrytning 1. MicroRNA transkriberas från introner eller exoner kodning eller icke-kodande gener och är klyvs i kärnan av DROSHA, till föregångare MicroRNA (pre-MicroRNA), som är kort stam-loop strukturer av 70 nukleotider2. Efter cytoplasmiska export, pre-MicroRNA är bearbetas vidare av DICER till mogen MicroRNA som spänner över 18 – 25 nukleotider3,4. Därefter införlivar RNA-inducerad ljuddämpningssystemet komplexet (RISC) dessa MicroRNA som enkelsträngat RNA, vilket möjliggör deras bindning till 3′ oöversatta regionen (3′-UTR) i deras mål mRNA att undertrycka sin expression3,5 .
Inom de senaste tre decennierna, eftersom de identifierades först, har MicroRNA framkommit att master regulatorer av genuttryck, vars egna uttryck nivåer är väl kontrollerad6. Roller för MicroRNA har beskrivits i orgel utveckling7,8,9,10,11,12, underhåll av homeostas13,14 , liksom sjukdom sammanhang som inkluderar neurologiska15,16,17,18,19, kardiovaskulära20, autoimmuna tillstånd21 ,22, cancer23,24och andra25. Den ökande uppskattning för relevansen av miRNA uttrycksmönster har fört fram behovet av tillförlitlig upptäckt metoder för miRNA avskrifter. Sådana metoder inkluderar realtid PCR, microarrays, Northern Blotting, i situ hybridisering och andra, som varierar i känslighet, specificitet och kvantitativa makt, huvudsakligen på grund av att miRNA avskrifter består av korta och Mycket homologa sekvenser6.
Vi rapporterade nyligen en viktig roll för miRNA-182 i utvecklingen av den myokardiella hypertrofi26, ett villkor som beskriver den strukturella anpassningen av hjärtat som svar på förhöjda hemodynamiska krav27,28. Hjärthypertrofi kännetecknas av ökningen i den hjärtinfarkt massan, som om associerade med maladaptiv remodeling29, kan leda till ökad risk för hjärtsvikt, ett tillstånd som redovisning för 8,5% av alla dödsfall tillskrivas hjärt- sjukdom30.
Här beskriver vi våra protokoll som kombinerar i situ hybridisering med digoxigenin-märkt (DIG) låst nukleinsyra (LNA) sond och immunfärgning för samtidiga detektion av miRNA och protein molekyler på mus hjärtat vävnadssnitt, i våra modell av hjärthypertrofi.
Protocol
Representative Results
Discussion
miRNA avskrift upptäckt kan uppnås genom olika tekniker som varierar i känslighet, specificitet och kvantitativa makt. Här visar vi kopplingen av miRNA i situ hybridisering med immunfärgning och beskriva ett protokoll som möjliggör samtidiga bedömningen av de uttryck av miRNA och protein molekyler, på avsnitten samma hjärta. Vi visar först hur du utför i situ hybridisering av gräva-märkt LNA miRNA sonder på paraffin inbäddade hjärtat sektioner. Därefter beskriver vi hur du utför immun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Athanasios Papangelis, för kritiska synpunkter på manuskriptet. FM stöds av bioteknik och biologiska Sciences Research Council (BBSRC; BB/M009424/1). IP stöds av amerikanska hjärtat Association vetenskapsman utveckling bidraget (17SDG33060002).
Materials
| Diethylpyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | DEPC |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | PBS |
| Tween-20 | American Bioanalytical | AB02038 | non-ionic surfactant |
| Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma Aldrich | 3115879001 | ProK |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | PFA |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | S271 | NaCl |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | ThermoFisher | M33 | MgCl2 |
| Tris | Sigma Aldrich | T6066 | |
| Hydrochloric Acid Solution, 1 N | ThermoFisher | SA48 | HCl |
| Hydrochloric Acid Solution, 12 N | ThermoFisher | S25358 | HCl |
| 1-Methylimidazole | Sigma Aldrich | 336092 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | 39391 | EDC |
| Hydrogen peroxide solution H2O2 | Sigma Aldrich | 216763 | H2O2 |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804 | Sodium Citrate |
| miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) | Qiagen | 339450 | scramble miRNA/U6 snRNA |
| miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe | QIagen | YD00615701 | 5'-DIG and 3'-DIG labelled |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647 | BSA |
| NBT/BCIP Tablets | Sigma Aldrich | 11697471001 | NBT-BCIP |
| Potassium Chloride | ThermoFisher | P217 | KCl |
| DAPI solution (1mg/ml) | ThermoFisher | 62248 | DAPI |
| Glass coverslip | ThermoFisher | 12-545E | Glass coverslip |
| Plastic coverslip | Grace Bio-Labs | HS40 22mmX40mmX0.25mm | RNA-ase free plastic coverslip |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | DIG antibody |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | Pap pen |
| Anti-Cardiac Troponin T antibody | Abcam | ab92546 | cTnT antibody |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-11011 | anti-rabbit-568 antibody |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | mounting medium |
| Sheep serum | Sigma Aldrich | S3772 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Deionized Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | |
| Hybridization Oven | ThermoFisher | UVP HB-1000 Hybridizer |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
- Hutvagner, G., Zamore, P. D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science. 297, 2056-2060 (2002).
- Krol, J., et al. Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design. Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).
- Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. Vertebrate microRNA genes. Science. 299, 1540 (2003).
- Tian, T., Wang, J., Zhou, X. A review: microRNA detection methods. Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).
- Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. MicroRNAs potentiate neural development. Neuron. 64, 303-309 (2009).
- Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).
- Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. Embryonic stem cell-specific MicroRNAs. Developmental cell. 5, 351-358 (2003).
- Kasper, D. M., et al. MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos. Developmental cell. 40, 552-565 (2017).
- Liu, N., Olson, E. N. MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development. Developmental cell. 18, 510-525 (2010).
- Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
- Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).
- Ying, W., et al. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity. Cell. 171, 372-384 (2017).
- Perkins, D. O., et al. microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder. Genome biology. 8, R27 (2007).
- Miller, B. H., et al. MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).
- Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion. Cell. 152, 262-275 (2013).
- Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research. Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).
- Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
- Ikeda, S., et al. Altered microRNA expression in human heart disease. Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).
- Mann, M., et al. An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses. Nature Communications. 8, 851 (2017).
- O’Connell, R. M., et al. MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development. Immunity. 33, 607-619 (2010).
- Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy. Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).
- He, L., et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature. 447, 1130-1134 (2007).
- Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
- Li, N., et al. miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart. Science Reports. 6, 21228 (2016).
- Meerson, F. Z. Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency. Circulation Research. 10, 250-258 (1962).
- Tardiff, J. C. Cardiac hypertrophy: stressing out the heart. Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).
- Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2. Circulation. 128, 388-400 (2013).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146-e603 (2017).
- Pena, J. T., et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nature Methods. 6, 139-141 (2009).
