लाइव सेल इमेजिंग के TGF-β/Smad3 संकेतन मार्ग में इन विट्रो और Vivo में एक एडीनोवायरस रिपोर्टर प्रणाली का उपयोग
Summary
यहां, हम TGF के लाइव सेल इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत-β/Smad3 संकेतन गतिविधि एक एडीनोवायरस रिपोर्टर प्रणाली का उपयोग कर । इस प्रणाली को वास्तविक समय में transcriptional गतिविधि पटरियों और इन विट्रो में और जीवित पशु मॉडल में दोनों एकल कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता है।
Abstract
परिवर्तन वृद्धि कारक β (TGF-β) संकेतन सेलुलर homeostasis के लिए आवश्यक कई महत्वपूर्ण कार्यों को नियंत्रित करता है और आमतौर पर कैंसर सहित कई रोगों में व्यक्त किया जाता है । TGF-β जोरदार देर स्टेज कैंसर प्रगति के दौरान मेटास्टेसिस में फंसाया, प्रवासी और इनवेसिव ट्यूमर कोशिकाओं का एक सबसेट को सक्रिय. संकेत मार्ग विश्लेषण के लिए वर्तमान तरीकों समापन बिंदु मॉडल पर ध्यान केंद्रित है, जो अक्सर को मापने के लिए प्रयास की जैविक घटना के बाद हॉक और रोग के प्रगतिशील प्रकृति को प्रतिबिंबित नहीं करते । यहां, हम TGF के लिए विशिष्ट एक उपंयास एडीनोवायरस रिपोर्टर प्रणाली प्रदर्शित β/Smad3 संकेत मार्ग है कि जीवित कोशिकाओं में transcriptional सक्रियण का पता लगा सकते हैं । एक विज्ञापन का उपयोग -CAGA12-टीडी-टॉम रिपोर्टर, हम इन विट्रो में24 ज के भीतर एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं के १००% संक्रमण दर हासिल कर सकते हैं । एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर का उपयोग transcriptionally सक्रिय कोशिकाओं की प्रत्यक्ष पहचान के साथ वास्तविक समय में लाइव एकल कोशिकाओं के इमेजिंग के लिए अनुमति देता है । TGF-β के साथ संक्रमित कोशिकाओं की उत्तेजना transcriptionally सक्रिय और विशिष्ट जैविक कार्यों में शामिल हैं कि कोशिकाओं का केवल एक सबसेट प्रदर्शित करता है । इस दृष्टिकोण उच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता के लिए एक एकल कोशिका स्तर पर TGF-β मेंसंकेतन से संबंधित जैविक कार्यों की समझ को बढ़ाने के लिए अनुमति देता है । Smad3 transcriptional गतिविधि भी vivo में एक विज्ञापन-CAGA12-ल्यूक रिपोर्टर के आवेदन के माध्यम से वास्तविक समय में सूचित किया जा सकता है । Ad-CAGA12-ल्यूक पारंपरिक छुरा transfected luciferase सेल लाइनों के रूप में एक ही तरीके से मापा जा सकता है । Smad3 transcriptional vivo में प्रत्यारोपित कोशिकाओं की गतिविधि पारंपरिक IVIS इमेजिंग के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है और निगरानी लाइव ट्यूमर प्रगति के दौरान, TGF-β संकेतन मार्ग की गतिशीलता में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान. हमारे प्रोटोकॉल एक लाभप्रद रिपोर्टर वितरण लाइव सेल के दोनों विट्रो में और vivo मेंसंकेत रास्ते के त्वरित उच्च प्रवाह इमेजिंग के लिए अनुमति देने प्रणाली का वर्णन है । इस विधि छवि की एक सीमा के लिए विस्तारित किया जा सकता है आधारित परख और प्रस्तुत दोनों बुनियादी जीव विज्ञान और चिकित्सीय विकास के लिए एक संवेदनशील और reproducible दृष्टिकोण के रूप में ।
Introduction
बदलने के विकास कारक β (TGF-β) एक आवश्यक cytokine मानव विकास में फंसा है कि एक heterodimeric परिसर के माध्यम से संकेत प्रकार द्वितीय और प्रकार मैं1रिसेप्टर्स से मिलकर. भर्ती और प्रकार मैं रिसेप्टर, जो बारी phosphorylates बहाव Smad2/3 प्रोटीन2,3में फास्फारिलीकरण में द्वितीय रिसेप्टर परिणाम टाइप करने के लिए बाध्यकारी । इन सक्रिय Smad2/3 प्रोटीन Smad4 को बांध, एक जटिल है कि नाभिक में translocates बनाने और जीन प्रतिलेखन4को नियंत्रित करता है । Under समस्थिति conditions TGF-β/Smad संकेतन कसकर विनियमित है; हालांकि, कई रोगों में, संकेतन मार्ग विनियमित है और अक्सर5,6,7रोग की प्रगति के लिए अग्रणी व्यक्त । हाल के अध्ययनों से यह प्रदर्शित किया है कि सेलुलर रिस्पांस TGF-β heterogenous है और TGF-β/Smad के उपजनसंख्या सक्रिय कोशिकाओं को एक समय पर निर्भर तरीके से जैविक समारोह के लिए जिंमेदार है8,9। TGF के आम सेलुलर विश्लेषण-β/Smad सिग्नलिंग निश्चित समापन बिंदु परख है कि सेलुलर गतिविधि का केवल एक स्नैपशॉट प्रदान करते है और अक्सर औसत TGF-β/Smad प्रभाव10quantitate का उपयोग शामिल है । इन विधियों, तथापि, सही TGF के आणविक व्यवहार का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं-β/Smad रोग प्रगति के दौरान शारीरिक स्थिति में संकेतन. छवि आधारित लाइव कोशिकाओं के विश्लेषण दोनों एक स्थानिक और लौकिक समझ के साथ सेलुलर और जैविक प्रक्रियाओं की गतिशीलता पर कब्जा ।
हमारा लक्ष्य TGF के लाइव सेल इमेजिंग के लिए एक संवेदनशील उच्च प्रवाह विधि विकसित करना था-β/Smad एडीनोवायरस-आधारित रिएजेंट का उपयोग कर संकेतन । यहां, हम संक्रमित मानव स्तन कैंसर सेल लाइन एमडीए-एमबी-२३१ एक एडीनोवायरस व्यक्त Smad3 CAGA आकृति बाध्यकारी अनुक्रम और एक luciferase (ल्यूक) या टीडी-टमाटर (टीडी-टॉम) रिपोर्टर जीन के साथ । Adenoviral रिपोर्टर सिस्टम प्लाज्मिड परिचय है कि कैंसर सेल लाइनों में एक १००% संक्रमण दर में परिणाम कर सकते है के लिए एक त्वरित और सस्ते विधि प्रदान करते हैं । Adenoviral रिपोर्टर सिस्टम भी सफलतापूर्वक सेल लाइनों है कि पारंपरिक प्लाज्मिड11के साथ transfect मुश्किल है के लिए लागू किया गया है । इस प्रोटोकॉल में हम एक reproducible और इनवेसिव प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए TGFβ के लाइव सेल इमेजिंग/Smad संकेत मार्ग दोनों vivo में और इन विट्रो मेंप्राप्त होगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम एक तकनीक विकसित की है वास्तविक समय इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए TGF-β/Smad3 एक जीवित कोशिकाओं में संकेतन । इस उपंयास विधि का उपयोग कर, हम पहले से गतिशील TGF-β/Smad3 transcriptional गतिविधि है कि बढ़ाया आक्रमण और प्रवास<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को राष्ट्रीय स्वास्थ्य एवं आयुर्विज्ञान अनुसंधान परिषद् (NHMRC) से एच-JZ तक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. TMBW ऑस्ट्रेलियाई सरकार और एन हेंडरसन टॉप से एक ऑस्ट्रेलिया स्नातकोत्तर पुरस्कार के एक प्राप्तकर्ता है साथी में ऑस्ट्रेलियाई रोटरी स्वास्थ्य से Templestowe के रोटरी के साथ छात्रवृत्ति और एक इलाज के लिए भोजन ।
Materials
| DMEM | ThermoFisher | 1881024 | Warm in 37 °C waterbath before use |
| Foetal Bovine Serum | Scientifix Life | FBS500-S | Heat inactivated before use |
| Recombinant Human TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21 | Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL |
| Hoechst-33258 | Tocris Bioscience | 5117 | Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL |
| Luciferase Reporter Assay Kit | Promega | 197897 | Dilute 5x in PBS before use |
| Luminometer | Promega | 9100-002 | |
| Phase contrast fluorescence microscopy | OLYMPUS | IX50 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810 R | |
| VivoGl Luciferin | Promega | P1041 | |
| IVIS Lumina III In Vivo Imaging System | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | ThermoFisher | 15400-054 | Diltue to 0.05% (1x) in PBS |
| Cell Culture Lysis 5x Reagent | Promega | E153A | Dilute to 1x in DDW |
| 10% Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| HEK 293A | ThermoFisher | R70507 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | CRM-HTB-26 | |
| PRKDC-SCID | Animal Resources Centre | SCIDF6 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Isoflurane | Zoetis | 26675-46-7 | |
| Ethanol | Chem-supply | EA043-10L-P | |
| Refresh Night Time | Allergan | 1750D | Lubricating Eye Ointment |
| Solution | Composition | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M) | ||
| FBS-DMEM | 5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin |
References
- Massague, J., Like, B. Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines. The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).
- Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation. Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).
- Massague, J. TGFbeta signaling in context. Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).
- Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).
- Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. Role of transforming growth factor beta in human disease. The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).
- Zhu, H. J., Burgess, A. W. Regulation of transforming growth factor-beta signaling. Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).
- Massagué, J. TGFβ in Cancer. Cell. 134, 215-230 (2008).
- Luwor, R. B., et al. Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity. Molecular cancer. 14, 50 (2015).
- Clarke, D. C., Liu, X. Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling. Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).
- Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).
- Luwor, R. B., et al. New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling. Growth factors. 29, 211-218 (2011).
- Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).
- Luwor, R. B., et al. Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo. Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).
- Reed, L. J., Muench, H. A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints. American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
- Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity. The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).
- Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines. Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49, 103-115 (2008).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4, 43-63 (2017).
- Wang, I. I., Huang, I. I. Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies. Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).
- Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).
- Wang, Q., Finer, M. H. Second-generation adenovirus vectors. Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).
- Durham, H. D., et al. Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue. Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).
- MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture. Blood. 96, 100-108 (2000).
- Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR. Biotechniques. 18, 444-447 (1995).
- Choi, Y., Chang, J. Viral vectors for vaccine applications. Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).
- de Cassan, S. C., et al. The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus. Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).
- Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).
- Wickham, T. J., et al. Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins. Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).
- Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. Virus vectors for gene delivery to the nervous system. Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).
- Zhou, F., et al. Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling. Nature communications. 5, 3388 (2014).
