Her presenterer vi en protokoll for levende celle imaging TGF-β/Smad3 signalnettverk aktivitet ved hjelp av en adenovirus reporter system. Systemet sporer transcriptional aktivitet i sanntid og kan brukes til både enkeltceller i vitro og i levende dyrmodeller.
Transformasjon av vekstfaktor β (TGF-β) signalering regulerer mange viktige funksjoner som kreves for mobilnettet homeostase og er vanligvis grunnlegge overexpressed i mange sykdommer, inkludert kreft. TGF-β er sterkt involvert i metastasering under sent stadium kreft progresjon, aktivere et delsett av trekkfugler og invasive kreftceller. Gjeldende metoder for signalering sti analyse fokuserer på sluttpunktet modeller, som ofte forsøker å måle signalnettverk innlegg-hoc av biologiske hendelsen og reflekterer ikke progressive natur sykdommen. Her viser vi en roman adenovirus reporter systemet bestemt for den TGF-β/Smad3 signalveien som kan oppdage transcriptional aktivisering i levende celler. Bruker en Ad-CAGA12-Td-Tom reporter, kan vi oppnå en 100% infeksjon rate av MDA-MB-231 celler i 24 h i vitro. Bruk av fluorescerende reporter tillater avbilding av live enkeltceller i sanntid med direkte identifikasjon av transcriptionally aktive celler. Stimulering av infiserte celler med TGF-β viser bare et delsett av celler som er transcriptionally aktive og involverte i bestemte biologiske funksjoner. Denne tilnærmingen gir høy spesifisitet og følsomhet på en enkelt cellenivå å øke forståelsen av biologiske funksjoner knyttet til TGF-β signalnettverk i vitro. Smad3 transcriptional aktivitet kan også rapportert i vivo i sanntid gjennom bruk av en Ad-CAGA12– Luc reporter. Ad-CAGA12– Luc kan måles på samme måte som tradisjonelle stabilt transfekterte luciferase linjer. Smad3 transcriptional aktiviteten til cellene implantert i vivo kan analyseres gjennom konvensjonelle IVIS avbildning og overvåket live under svulst progresjon, gir unik innsikt i dynamikken i TGF-β signalveien. Våre protokollen beskriver en fordelaktig reporter leveringssystem muliggjør rask høy gjennomstrømming avbilding av levende celle signalnettverk trasé både i vitro og i vivo. Denne metoden kan utvides til en rekke bilde basert analyser og gaver som en følsom og reproduserbar tilnærming til både grunnleggende biologi og terapeutiske utvikling.
Transformasjon av vekstfaktor β (TGF-β) er en viktig cytokin innblandet i menneskelig utvikling som signaliserer gjennom en heterodimeric består av type II og type I-reseptorer1. Binding til type II reseptor resulterer i rekruttering og fosforylering typen jeg reseptoren, som i sin tur phosphorylates nedstrøms Smad2/3 proteiner2,3. Dette aktivert Smad2/3 proteiner binde til Smad4, danner et kompleks som translocates til kjernen og regulerer genet transkripsjon4. Under homøostatisk forhold TGF-β/Smad er signalering strengt regulert; men i mange sykdommer, signalveien er deregulert og ofte overexpressed fører til progresjon av sykdommen5,6,7. Nyere studier har vist at cellulær respons til TGF-β er heterogene og subpopulasjoner av TGF-β/Smad aktive cellene er ansvarlige for biologisk funksjon i en tidsavhengige måte8,9. Vanlige mobilnettet analyse av TGF-β/Smad signalering innebærer bruk av fast endepunktet analyser som gir bare et øyeblikksbilde av cellulære aktiviteten og ofte quantitate gjennomsnittlig TGF-β/Smad effekt10. Disse metodene, men kan ikke nøyaktig representere molekylær oppførsel av TGF-β/Smad signalering i fysiologisk tilstand under sykdomsprogresjon. Image-basert analyse av lever celler fange dynamikken i mobilnettet og biologiske prosesser med både en romlig og timelige forståelse.
Målet var å utvikle en følsom høy gjennomstrømming metode for levende celle avbilding av TGF-β/Smad signalering bruker adenovirus-baserte reagenser. Her infisert vi menneskelig bryst kreft cellen linjen MDA-MB-231 med en adenovirus uttrykke Smad3 CAGA motiv bindende sekvensen og luciferase (Luc) eller Td-tomat (Td-Tom) reporter genet. Adenoviral reporter systemer er en rask og billig metode for plasmider introduksjon som kan resultere i en 100% infeksjon rate i kreftcelle linjer. Adenoviral reporter systemer har også vært anvendt på linjer som er vanskelige å transfect med konvensjonelle plasmider11. I denne protokollen vil vi beskrive en reproduserbar og noninvasive prosess for å oppnå levende celle avbildning av TGFβ/Smad-signalveien både i vivo og i vitro.
Vi har utviklet en teknikk for å muliggjøre sanntids avbilding av TGF-β/Smad3 signalering i live enkeltceller. Bruker denne romanen metoden, har vi tidligere identifisert en sub-populasjon av celler med dynamisk TGF-β/Smad3 transcriptional aktivitet som ble tilknyttet forbedret invasjon og overføring8. Denne metoden forbedrer på tradisjonelle analyser for TGF-β signalnettverk, som vestlige blots av Smad3 fosforylering og TGF-β målrettet genuttrykk, ved å fange heterogenitet av TGF-β/Sma…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Health and Medical Research Council (NHMRC) til H-JZ. TMBW er en mottaker av en Australia Postgraduate Award fra den australske regjeringen og Ann Henderson påfylling stipend fra australske Rotary helse i partner med roterende av Templestowe og Dine for en kur.
DMEM | ThermoFisher | 1881024 | Warm in 37 °C waterbath before use |
Foetal Bovine Serum | Scientifix Life | FBS500-S | Heat inactivated before use |
Recombinant Human TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21 | Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL |
Hoechst-33258 | Tocris Bioscience | 5117 | Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL |
Luciferase Reporter Assay Kit | Promega | 197897 | Dilute 5x in PBS before use |
Luminometer | Promega | 9100-002 | |
Phase contrast fluorescence microscopy | OLYMPUS | IX50 | |
Centrifuge | eppendorf | 5810 R | |
VivoGl Luciferin | Promega | P1041 | |
IVIS Lumina III In Vivo Imaging System | PerkinElmer | CLS136334 | |
0.5% Trypsin-EDTA (10x) | ThermoFisher | 15400-054 | Diltue to 0.05% (1x) in PBS |
Cell Culture Lysis 5x Reagent | Promega | E153A | Dilute to 1x in DDW |
10% Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
HEK 293A | ThermoFisher | R70507 | |
MDA-MB-231 | ATCC | CRM-HTB-26 | |
PRKDC-SCID | Animal Resources Centre | SCIDF6 | |
Matrigel | Corning | 354234 | |
Isoflurane | Zoetis | 26675-46-7 | |
Ethanol | Chem-supply | EA043-10L-P | |
Refresh Night Time | Allergan | 1750D | Lubricating Eye Ointment |
Solution | Composition | ||
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M) | ||
FBS-DMEM | 5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin |