여기에 설명 된 프로토콜 여분 장 사이트에 결에서 이주 하는 면역 세포를 특별히 식별 하 신생아 쥐에 photolabeling 접근을 사용 합니다. 이 전략은 초기 생활에 호스트-미생물 상호작용 연구에 유용할 것 이다.
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방법 논문
Vivo에서 Photolabeling 신생아 쥐에 있는 조 혈 모 세포의 이동성 잠재력을 평가 하는 콜론에 셀의
이 논문에서
요약
초록
장의 세균 지역 사회는 인생에서 일찍 고 면역 전지 개발 및 기능에 영향을 미칠. 신생아 microbiota 항생제 사용과 다이어트, 면역 및 염증 성 질병에 자화 율에 미치는 영향을 포함 하 여 수많은 외부 영향을 받기 쉽습니다. 장애 선 동적인 장 질병 (IBD) 등 내장에 면역 세포의 대규모 유입에 의해 특징. 그러나, 면역 세포는 microbiota에 의해 조절 또한 여분 장 사이트에 면역 반응에 영향을 창 자에서 이주 수 있습니다. 따라서, 식별 하 고 원심 사이트에 창 자에서 미생물 메시지를 전달 수 있습니다 셀을 특성화 하는 필요가 있다. 여기, 우리 신생아 쥐에 vivo에서 마이그레이션 후 장 외 사이트에 그들의 식별을 가능 하 게의 콜론에 레이블 셀 하는 방법을 설명 합니다.
서론
포유류 위장 항만 호스트1과 공생 관계에 존재 하는 박테리아의 종의 수백. 면역 세포 로컬 환경에 이러한 미생물과 평화공존을 적용 하 고 병원 체 침입에 대 한 보호벽을 설치. 따라서, 면역 세포와는 microbiota 간의 양방향 상호 작용은 숙주 면역 체계를 교육 하 고 병원 체를 면역 반응에 대 한 임계값을 설정 하는 공생 공동체 확립을 중요 합니다. 미생물 또는 dysbiosis, 구성, 수에서 변경 면역 항상성 교란 및 면역 중재 질병 타입-1 당뇨병 및 IBD2,3 로 이어지는 장 염증을 억제 하는 규제 회로 교란 .
기간 출생은 장내 미생물 지역 사회 동시에 면역 체계를 구축 하기 시작 하는 독특한 발달 창 후에 즉시4성숙. 출생 후 microbiota 안정, 자연스럽 게 발생 하는 지역 사회 구성 및 자주5의 변화 되지 않습니다. 면역 세포는 microbiota와 상호 작용 하는 두 가지 해 부 위치 내장-에서 lamina propria 와6
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프로토콜
모든 동물 절차 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 매사 추세 츠 종합 병원에서 준수와의 수행 했다.
주의:이 프로토콜 클래스 3b 레이저 (LG3)의 사용을 포함. LG3 레이저 안전 고글이이 레이저를 작동 하는 경우에 항상 사용 해야 합니다. 적절 한 교육 및 안전 지침 부상의 위험을 피하기 위해 따라야 합니다.
1. 디자인 및 레이저
- 라이트-발광 다이오드 (LED)를 연결 (405 nm, 19.3 mW, 1400 mA, 섬유 결합) 하는 LED 드라이버를 통해 오는 4 핀 M8 커넥터 케이블 LED에 연결. 조심 스럽게 연결 고정 하는 나사를 조입니다.
- Optogenetics 패치 케이블 LED를 연결 하기 전에 커넥터를 잡고 LED의 최대 개방 거기 있도록 빛은 볼 수 없는 장애물. 필요한 경우 이물질을 제거 하 여 optogenetics 패치 케이블을 삽입 구멍에 불어.
- 커넥터 슬리브의 한쪽 끝에는 정을 삽입 하 여 섬유 광섬유 정 optogenetics 패치 케이블을 연결 합니다. 패치 케이블을 커넥터 슬리브의 다른 쪽 끝을 연결 합니다. 연결을 보호 하지만 구부리거나 광섬유를 정 맥에 휴식을 조....
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결과
광섬유 케이블은 2 일 오래 된 팜과excised 쥐의 콜론에 405 nm 빛을 전달 하기 위해 사용 되었다. 이전 실험에서 30 s 노출 최소 세포 (그림 1A) 독성 결 장 세포의 최대 photoconversion에 게 결정 했다. 따라서, 콜론의 다른 세그먼트의 순차 30 s 노출 프로토콜에 설명 된 대로 실시 했다. 레이저 노출에 따라 쥐 즉시 안락사 했다, 그리고 셀의 photoconversion 결정 했다. 총 결 장 조직의 단일 셀 준비 했다 형광 활용 된 안티 CD45 항 체로 얼룩진 고 흐름 cytometric 분석 photoconversion를 검출 하기 위하여 수행 되었다. 비전향 Dendra2-그린 (Dendra-g) 각각 490 553 nm에서 여기 및 방출 맥시 마는 단백질과 photoconverted Dendra2-레드 (Dendra-r) 단.......
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토론
상호 작용 하 고 결 장에서 microbiota에 의해 영향을 하는 셀의 특성을 확인 하 고 중요 하 고 어떻게 막 microenvironment에서 정보는 시체의 나머지 부분에 릴레이의 이해를 촉진 한다. 창 자 관련 셀 마이그레이션 공부에 대 한 한 가지 방법은 그들의 조직을 추적 패턴12,13함수를 받는 쥐로 입양 전송 다음 창 자 관련 된 세포의 필요 합니다. 이 접근은 제한으로 전송 된 특정 셀 종류만을 추적할 수 있습니다. 또한, 조직 및 정화 과정에서 세포의 고립에서 발생 하는 아티팩트 vivo에서 철새 프로세스를 방해 수 있습니다. 더 많은 최근 내 시경 photoconversion 프로토콜 창 자 세포가 마우스를 사용 하 여 라벨을 보고14이었다. 이 연구는 성인 쥐에 백혈구는 소장에서의 광범위 한 매매 발견.
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
Nitya 자이나교는 NIH/NIAID 경력 전환 상 1K22AI116661-01에 의해 지원 되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| <강>레이저 | |||
| 발광 다이오드(LED) | THORLABS | M405FP1 | 주의: 이것은 클래스 3b 레이저입니다. 레이저를 사용할 때는 보안경을 착용해야 합니다. 1400mA의 전류로 405nm 파장을 방출합니다. 광섬유 결합입니다. SMA 커넥터를 수용합니다. |
| https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 LED 드라이버 | THORLABS | LEDD1B | 레이저를 통해 1200mA의 정전류를 구동합니다. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| 광유전학 패치 케이블 | THORLABS | M87L01 | SMA 커넥터가 있는 1m 길이의 케이블. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| 광섬유 캐뉼라 | Doric 렌즈 | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5mm 길이의 캐뉼라, 외경 500 &마이크로; m 및 480 &m의 내경. NA 값은 0.5입니다. 페룰은 지르코니아, 1.25mm OD입니다. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| 전원 공급 장치 | THORLABS | KPS101 | 2.4 A의 전류로 15 V를 공급 https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 레이저 안전 고글 | THORLABS | LG3 | 오렌지 렌즈는 47%의 가시광 투과율 https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| 레드 라이트를 제공합니다. | 전자 현미경 과학 | 74327-10 | 15 W 램프 https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
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| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg 프리 |
| https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 송아지 세럼 | 하이클론 AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5M 농도 |
| https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 DTT | Sigma | 10197777001 | 주의: 삼키면 유해하며 피부 자극을 유발합니다. 1M 농도 |
| https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M 농도 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| 페트리 접시 | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 미크론 셀 스트레이너 | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| 마이크로 마그네틱 스티어 바 | Fisherbrand | 1451364 | 사용 후 70% 에탄올로 헹굽니다. 매번 사용하기 전에 증류수로 여러 번 헹굽니다. 막대는 길이가 8mm이고 팔각형 모양입니다. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| 자석 교반 판 | 코닝 실험실 교반기 | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| 콜라겐 분해 효소 | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| 피펫 보조제 | Thermo Scientific | 14387165 | |
| https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 10 mL 혈청학적 피펫 | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL 혈청학적 피펫 | Falcon | 357515 | |
| https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 15 mL 코니컬 원심분리기 튜브 | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL 코니컬 원심분리기 튜브 | Thermo Scientific | 339653 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 | |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | 1.5 mL를 담을 수 있습니다. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| 조직 균질화기 | Kimble | K7495400000 | 2개의 AA 배터리가 필요합니다. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| 호모게나이저 팁 | Kimble | 7495210590 | 플라스틱, 0.5 mL 팁 https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK 용해 버퍼 | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 미크론 셀 스트레이너 | Falcon | 08-771-1 | |
| https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711Antibodies | |||
| BV786 안티-마우스 CD45 | BD | 564225 | 클론 3O-F11 |
| https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 라이브/데드 | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| 기타 | |||
| 면도기 블레이드 | VWR | 55411-050 | 참수에 사용합니다. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
참고문헌
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489, 231-241 (2012).
- Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. Journal of Immunology. 198
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