JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
생물학

Nasal potentielle forskel at kvantificere Trans-epitelial Ion Transport i mus

Published: July 04, 2018
doi:
10.3791/57934
,
1Louvain Center for Toxicology and Applied Pharmacology (LTAP), Institut de Recherche Expérimentale et Clinique (IREC),Université Catholique de Louvain

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at måle nasal spændingsforskel i mus. Testen kvantificerer funktion af transmembrane ion transportvirksomheder som cystisk fibrose transmembrane ledningsevne regulator og epitelial natrium-kanal. Det er værdifuldt at evaluere effekten af nye terapier for cystisk fibrose.

Abstract

Den nasale potentielle forskel test har været brugt i næsten tre årtier til at bistå ved diagnosticeringen af cystisk fibrose (CF). Det har vist sig at være nyttige i tilfælde af svækket, oligo – eller mono-symptomatisk former for CF normalt diagnosticeres senere i livet, og CF-relaterede lidelser som medfødt bilaterale fravær af sædlederen, idiopatisk kronisk pancreatitis, allergiske Bronchopulmonary aspergillose, og bronchiectasis. I både kliniske og prækliniske indstillinger, har prøven været brugt som en biomarkør at kvantificere svar til målrettede terapeutiske strategier jf. tilpasning test til en mus er udfordrende og kan medføre en tilhørende dødelighed. Dette papir beskriver den passende dybde af anæstesi forpligtet til at opretholde et tilstoppet kateter i situ for kontinuerlig perfusion. Det viser en liste over foranstaltninger for at undgå bronchopneumoni-aspiration af løsninger perfunderet i næsen. Det beskriver også de dyrs pleje i slutningen af testen, herunder administration af en kombination af modgift af de bedøvende stoffer, fører til hurtigt vende anæstesi med fuld tilbagebetaling af dyrene. Repræsentative data indhentet fra en CF og et wild-type mus viser, at testen forskelsbehandler CF og ikke-CF. Helt, protokollen beskrevet her giver pålidelige målinger af den funktionelle status af trans-epitelial chlorid og natrium transportvirksomheder i spontant vejrtrækning mus samt flere tests i de samme dyr samtidig reducere test-relaterede dødelighed.

Introduction

For næsten tre årtier, blev elektriske potentielle forskel (PD) målinger benyttet til at evaluere den funktionelle status af transmembrane ion transportvirksomheder givet udtryk for på næseslimhinden, som repræsentant for den distale airways1. Som en omstændelig dynamisk test2,3, nasal PD tillader funktionel dissektion af cystisk fibrose Transmembrane ledningsevne Regulator (CFTR) og epitelial natrium kanalen (ENaC) aktivitet, lokaliseret både på de apikale membraner af epitelceller og øve afgørende roller i luftvejene overflade hydrering. Den store klinisk anvendelse af den nasale PD test er at bistå ved diagnosticeringen af CF, den mest almindelige fatal genetisk sygdom i kaukasiske populationer med en gennemsnitlige incidens af 1 ud af 2.500 levendefødte i europæiske lande. Testen har længe vist sig nyttigt ved diagnosticering af svækkede, oligo – eller mono-symptomatisk former for CF normalt diagnosticeres senere i livet, og CF-relaterede lidelser som medfødt bilaterale fravær af sædlederen, idiopatisk kronisk pancreatitis, allergiske Bronchopulmonary aspergillose, og bronchiectasis4. For nylig, clinometric evaluering af den terapeutiske graduering af den grundlæggende CFTR defekt5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16 har gjort brug af den nasale PD i kliniske forsøg med nye CF behandlingsformer. I indstillingen prækliniske er testen blevet tilpasset til musen17 at tillade undersøgelse af bioactivity af nye CF target terapier18,19,20,21. I mus er teknikken delikat, baseret på arter-relaterede anatomiske forskelle i størrelsen af det nasale området mellem gnavere og mennesker, og især på den vigtige rolle af sensoriske input fra nasofacial-regionen i gnavere. Det kræver uddannede og dygtige erhvervsdrivende, dedikeret udstyr og forsyninger.

CF er en multi systemisk sygdom i eksokrine kirtler, i hvilke kronisk respiratorisk sygdom dominerer det kliniske billede. Sygdommen er forårsaget af mutationer i det gen, der koder for cyklisk adenosin fra (cAMP)-reguleret CFTR klorid-kanal22. Til dato, har mere end 2.000 CFTR mutationer været identificeret23. Den mest almindelige mutation24,25, fundet i næsten 90% af CF alleler, svarer til en sletning af fenylalanin i polypeptid kæde af protein (F508del-CFTR) stilling 508. CFTR protein er en rent ohmske lille konduktans klorid-kanal. Der er også betydelige beviser at CFTR regulerer andre transportmekanismer, navnlig ENaC26,27. Defekte elektrolyt transport, herunder reduceret CFTR-afhængige chlorid ledningsevne og øget ENaC-afhængige natrium ledningsevne, er kendetegnende for CF epitheler. Den tidligere defekt afspejles af en nedsat eller afskaffet repolarisering svar på både en elektrokemisk gradient favorisere chlorid efflux og tilsætning af isoprenaline (en β-adrenerge agonist, der øger intracellulære cAMP) eller forskolin (en adenylate cyclase agonist, ikke godkendt til klinisk brug). Den sidstnævnte defekt afspejles af en basal hyperpolarisering næseslimhinden (en mere negativ PD) og en øget respons på amilorid, et vanddrivende lægemiddel, der blokerer ENaC28.

CF musemodeller har været hyppigt anvendt i CF forskning og har været uvurderlige i dissekere CF patologi. I dag, har mindst femten modeller været beskrevet29, hvoraf tre er homozygote for den mest klinisk relevante F508del mutation30,31,32. En af disse tre stammer30, udviklet på Erasmus universitetet i Rotterdam, har været brugt i næsten 20 år i Université catholique de Louvain (UCL) laboratorium. Cftrtm1Eur model30 har vist sig for at være meget nyttige til at studere den multiorgan Patofysiologi af CF sygdom og teste effekten af nye terapeutiske strategier18,19,20, 21. Mange problemer kan opstå under eller tidlig efter (< 24 h) den nasale PD test i mus. I dette papir, den passende dybde af anæstesi kræves for at holde et tilstoppet kateter i situ for kontinuerlig perfusion og foranstaltninger til at undgå bronchopneumoni-aspiration af løsninger perfunderet i næsen er beskrevet. Dyrs pleje i slutningen af testen er også beskrevet, herunder administration af en kombination af modgift af bedøvende stoffer, fører til hurtigt vende anæstesi med fuldstændig genopretning af dyrene. Helt, disse procedurer giver mulighed for pålidelige målinger i spontant vejrtrækning mus, reduceret test-relaterede dødelighed og gentage testen i samme dyr. Repræsentative data indhentet fra den nasale PD test i en CF og i en wild-type mus er vist og diskuteret.

Murine nasal PD forsøgsprotokollen er rapporteret i tre sessioner: vurdering og styring før, under og efter testen. I den præ-test vurdering og forvaltning, er forberedelse af dobbelt lumen nasale kateteret og løsninger, der anvendes til løbende nasal perfusion-protokollen beskrevet i detaljer. Under den vurdering og forvaltning af dele af prøven, er eksperimentel opsætning og håndtering af musen minutiøst dissekeret. Endelig, forvaltning af dyr ved testens afslutning er beskrevet for at forbedre fuld animalske opsving.

Protocol

Undersøgelser og procedurer blev godkendt af en etisk komité for animalsk forskning af UCL (2017/UCL/MD/015) og i overensstemmelse med Fællesskabets regler for brug af dyr i forskning (CEE n ° 86/609). Efterforskere er kvalificerede til dyreforsøg efter direktiv 2010/63/EU af Europa-Parlamentet og Rådet af 22 September 2010 om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål. 1. før test vurdering og styring af Udarbejde dobbelt lumen nasale kateteret.Bemærk: E…

Representative Results

For at illustrere karakteristiske ion transport abnormiteter i CF, blev nasal PD målinger udført efter den protokol, der er beskrevet ovenfor i en F508del-CF-mus og et wild-type kontrol over FVB/129 genetiske baggrund fra Bruxelles koloni CFTRtm1Eur mus30. Denne klinisk relevante model, husly det mest almindelige og en af de mest alvorlige F508del-CFTR mutation23,24,<sup class="xref"…

Discussion

Formålet med dette papir er at beskrive en passende protokol til måling af nasal PD under kontinuerlig perfusion af løsninger i spontant vejrtrækning mus til en længde af tid, der kræves for at teste integriteten af ion transportvirksomheder, hovedsagelig CFTR og ENaC. Alle trin i protokollen har været grundigt optimeret til at sikre fuld animalske opsving og god kvalitet og reproducerbare data. I særlige, kritisk trin er anæstesi vurdering og styring og tilstrækkelig animalsk holdning og pleje under og efter t…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne takke Prof. J. Lebacq for kritisk redigering håndskriftet. CFTRtm1Eur (homozygote F508del-CFTR (FVB/129) mus blev udviklet af den Erasmus MC, Rotterdam, Nederlandene, med støtte fra EF europæisk koordinering indsats for forskning i cystisk fibrose EU FP6 LHHM-CT-2005-018932.

Materials

Portex polyethylene tube  Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD to prepare capillary tubes for nasal probe
Electrode cream Parker, Fairfield, NJ, USA Redux cream to build electrode bridges
Ag/AgCl electrodes Biomedical, Clinton Township, MI, USA JNS BNT131-1,0 measuring and reference electrodes
amiloride hydrochloride Sigma, St Louis, MI, USA A7410 to prepare perfusion solutions
forskolin Sigma, St Louis, MI, USA F6886 to prepare perfusion solutions
Knick Portamess voltmeter Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany Portavo 904 pH to measure potential difference
Paraly SW 112 Software  Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany Paraly SW112 software to capture potential difference data
midazolam  Mylan, Hoeilaart, Belgium Dormicum 15mg/3ml to serve as anaesthetic premedication
fentanyl Janssen Cilag, Berchem, Belgium Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml to serve as anaesthetic medication
medetomidine Orion Pharma, Espoo, Finland Domitor 1 mg/ml to serve as anaesthetic medication
droperidol  Janssen  Cilag, Berchem, Belgium Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml to serve as anaesthetic medication
clonidine  Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany Catapressan 0.15 mg/ml, to serve as anaesthetic medication
refernce IV catheter Becton Dickinson, Sandy, UT, USA 24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W to build electrode bridges
forceps  Fine science Tools, Heidelberg, Germany Dumont #5, Fine science Tools to place the nasal catheter
naloxone  Braun Medical, Brussels, Belgium Narcan, 0.4 mg/ml to serve as anaesthetic antagonist
atipamezole  Zoetis, Bloomberg, Belgium Antisedan, 5 mg/ml to serve as a medetomedine specific antidote 
Heating pads  Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA 18,8×37,5 cm; 15,5×15,5 cm to avoid hypothermia during and after the test
Peristaltic pump P1 GE Life Sciences, Uppsala, Sweden 18111091 to perfuse solutions in the mouse nose
cyanoacrylate glue Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany  super glue 3 to glue together two capillary tubes  for nasal probe
NaCl Sigma, St Louis, MI, USA RES0926S-A7 Pharma-Grade, USP
CaCl2.2H2O Sigma, St Louis, MI, USA M7304 Pharma-Grade, USP
MgCl2.6H2O Sigma, St Louis, MI, USA 1551128 Pharma-Grade, USP
K2HPO4 Sigma, St Louis, MI, USA 1551139 Pharma-Grade, USP
Na gluconate Sigma, St Louis, MI, USA S2054 Pharma-Grade, USP
Ca gluconate Sigma, St Louis, MI, USA C8231 Pharma-Grade, USP
MgSO4.7H2O Sigma, St Louis, MI, USA RES0089M-A7 Pharma-Grade, USP
BD needle  Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA BD 26G (0.45×10 mm) intraperitoneal injection
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knowles, M., Gatzy, J., Boucher, R. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in cystic fibrosis. New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1495 (1981).
  2. Middleton, P. G., Geddes, D. M., Alton, E. F. W. Protocols for in vivo measurement of the ion transport defects in cystic fibrosis nasal epithelium. European Respiratory Journal. 7 (11), 2050-2056 (1994).
  3. Knowles, M. R., Paradiso, A. M., Boucher, R. C. In vivo nasal potential difference: techniques and protocols for assessing efficacy of gene transfer in cystic fibrosis. Human Gene Therapy. 6 (4), 445-455 (1995).
  4. Paranjape, S. M., Zeitlin, P. L. Atypical cystic fibrosis and CFTR-related disorders. Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 35 (3), 116-123 (2008).
  5. Wilschanski, M., et al. A pilot study of the effect of gentamicin on nasal potential difference measurements in CF patients carrying stop mutations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (3), 860-865 (2000).
  6. Clancy, J. P., et al. Evidence that systemic gentamicin suppresses premature stop mutations in patients with CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163 (7), 1683-1692 (2001).
  7. Wilschanski, M., et al. Gentamicin-induced correction of CFTR function in patients with CF and CFTR stop mutations. New England Journal of Medicine. 349 (15), 1433-1441 (2003).
  8. Sermet-Gaudelus, I., et al. In vitro prediction of stop-codon suppression by intravenous gentamicin in patients with CF: a pilot study. BMC Medicine. 5, 5 (2007).
  9. Clancy, J. P., et al. No detectable improvements in CF transmembrane conductance regulator by nasal aminoglycosides in patients with CF with stop mutations. American Journal of Respiratory and Cell Molecular Biology. 37 (1), 57-66 (2007).
  10. Kerem, E., et al. Effectiveness of PTC124 treatment of CF caused by nonsensemutations: a prospective phase II trial. Lancet. 372 (9640), 719-727 (2008).
  11. Sermet-Gaudelus, I., et al. Ataluren (PTC124) induces CF transmembrane conductance regulator protein expression and activity in children with nonsense mutation CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (10), 1262-1272 (2010).
  12. Wilschanski, M., et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 38 (1), 59-69 (2011).
  13. Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with CF and the G551D-CFTR mutation. New England Journal of Medicine. 363 (21), 1991-2003 (2010).
  14. Clancy, J. P., et al. Results of a phase IIa study of VX-809, an investigational CFTR corrector compound, in subjects with cystic fibrosis homozygous for the F508del-CFTR mutation. Thorax. 67 (1), 12-18 (2012).
  15. Leonard, A., Lebecque, P., Dingemanse, J., Leal, T. A randomized placebo-controlled trial of miglustat in cystic fibrosis based on nasal potential difference. Journal of Cystic Fibrosis. 11 (3), 231-236 (2012).
  16. De Boeck, K., et al. CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate end-point. European Respiratory Journal. 41, 203-216 (2013).
  17. Leal, T., et al. Successful protocol of anaesthesia for measuring transepithelial nasal potential difference in spontaneously breathing mice. Laboratory Animals. 40 (1), 43-52 (2006).
  18. Lubamba, B., et al. Preclinical evidence that sildenafil and vardenafil activate chloride transport in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (5), 506-515 (2008).
  19. Lubamba, B., et al. Airway delivery of low-dose miglustat normalizes nasal potential difference in F508del cystic fibrosis mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (11), 1022-1028 (2009).
  20. Lubamba, B., et al. Inhaled PDE5 inhibitors restore chloride transport in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 37 (1), 72-78 (2011).
  21. Vidovic, D., et al. rAAV-CFTRΔR Rescues the Cystic Fibrosis Phenotype in Human Intestinal Organoids and Cystic Fibrosis Mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 288-298 (2016).
  22. Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
  23. Lubamba, B., Dhooghe, B., Noel, S., Leal, T. Cystic fibrosis: insight into CFTR pathophysiology and pharmacotherapy. Clinical Biochemistry. 45 (15), 1132-1144 (2012).
  24. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
  25. Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4925), 1066-1073 (1989).
  26. Stutts, M. J., Rossier, B. C., Boucher, R. C. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inverts protein kinase A-mediated regulation of epithelial sodium channel single channel kinetics. Journal of Biological Chemistry. 272 (22), 14037-14040 (1997).
  27. Ismailov, I. I., et al. Regulation of epithelial sodium channels by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biological Chemistry. 271 (9), 4725-4732 (1996).
  28. Althaus, M. ENaC inhibitors and airway re-hydration in cystic fibrosis: state of the art. Current Molecular Pharmacology. 6 (1), 3-12 (2013).
  29. Wilke, M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, 152-171 (2011).
  30. Van Doorninck, J. H., et al. A mouse model for the cystic fibrosis delta F508 mutation. The EMBO Journal. 14 (18), 4403-4411 (1995).
  31. Colledge, W. H., et al. Generation and characterization of a delta F508 cystic fibrosis mouse model. Nature Genetics. 10 (4), 445-452 (1995).
  32. Zeiher, B. G., et al. A mouse model for the delta F508 allele of cystic fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 96 (4), 2051-2064 (1995).
  33. Ghosal, S., Taylor, C. J., McGray, J. Modification of the nasal membrane potential difference with inhaled amiloride and loperamide in the cystic fibrosis (CF) mouse. Thorax. 51 (12), 1229-1232 (1996).
  34. Ghosal, S., Taylor, C. J., Colledge, W. H., Ratcliff, R., Evans, M. J. Sodium channel blockers and uridine triphosphate: effects on nasal potential difference in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 15 (1), 146-150 (2000).
  35. Leonard, A., et al. Comparative Variability of Nasal Potential Difference Measurements in Human and Mice. Open Journal of Respiratory Disease. 2, 43-56 (2012).
  36. Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch’s 3Rs then and now: the need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
  37. Pritchett-Corning, K. R., et al. AALAS/FELASA Working Group on Health Monitoring of rodents for animal transfer. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 633-640 (2014).
  38. Salinas, D. B., et al. CFTR involvement in nasal potential differences in mice and pigs studied using a thiazolidinone CFTR inhibitor. American Journal of Physiology. Lung Cell Molecular Physiology. 287 (5), 936-943 (2004).
  39. Fisher, J. T., et al. Comparative processing and function of human and ferret cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Journal of Biological Chemistry. 287 (26), 21673-21685 (2012).
  40. Kaza, N., et al. Use of ferrets for electrophysiologic monitoring of ion transport. PLoS One. 12 (10), 0186984 (2017).
  41. Leal, T., Beka, M., Panin, N., Mall, M. A., Noel, S. Nasal potential difference in βENaC-overexpressing mouse reveals pH-sensitive channel hyperactivity and shift of subunits stoichiometry. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (S1), 72 (2017).
  42. Mall, M., Grubb, B. R., Harkema, J. R., O’Neal, W. K., Boucher, R. C. Increased airway epithelial Na+ absorption produces cystic fibrosis-like lung disease in mice. Nature Medicine. 10 (5), 487-493 (2004).
  43. Shah, V. S., et al. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice. Science. 351 (6272), 503-507 (2016).

Tags

Nasal Potential DifferenceCystic FibrosisTransgenic MiceIon TransportDouble Lumen Nasal CatheterElectrolyte CreamVoltmeterPeristaltic PumpData Capture Software
check_url/kr/57934?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Beka, M., Leal, T. Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice. J. Vis. Exp. (137), e57934, doi:10.3791/57934 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image