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생물학

Différence de potentiel nasale pour quantifier le Transport des ions Trans épithélial chez la souris

Published: July 04, 2018
doi:
10.3791/57934
,
1Louvain Center for Toxicology and Applied Pharmacology (LTAP), Institut de Recherche Expérimentale et Clinique (IREC),Université Catholique de Louvain

Summary

Nous présentons ici un protocole permettant de mesurer la différence de potentiel nasale chez la souris. L’essai quantifie la fonction des transporteurs ioniques transmembranaires tels que le régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose kystique et le canal sodium épithélial. Il est utile d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements de la fibrose kystique.

Abstract

Le test de différence potentielle nasale a été utilisé depuis près de trois décennies pour aider dans le diagnostic de fibrose kystique (FK). Il s’est avéré utile dans les cas d’atténué, formes oligo – ou mono-symptomatique des FC généralement diagnostiquée plus tard dans la vie et de troubles liés au CF par exemple l’absence bilatérale congénitale des canaux déférents, pancréatite chronique idiopathique, allergique l’aspergillose broncho-pulmonaire et dilatation des bronches. Dans les paramètres cliniques et précliniques, le test a été utilisé comme un biomarqueur de quantifier les réponses aux stratégies thérapeutiques ciblées pour adapter CF. le test d’une souris est un défi et peut entraîner une mortalité associée. Cet article décrit la profondeur adéquate de l’anesthésie nécessaire pour maintenir un cathéter nasal in situ pour la perfusion continue. Il énumère les mesures pour éviter la broncho-aspiration de solutions perfusés dans le nez. Il décrit également les soins aux animaux à la fin de l’essai, y compris l’administration d’une combinaison d’antidotes des médicaments anesthésiques, menant à inverser rapidement l’anesthésie avec une récupération complète des animaux. Des données représentatives provenant d’un CF et une souris sauvage montrent que le critère discriminatoire entre FC et non-CF. Au total, le protocole décrit ici permet des mesures fiables de l’état fonctionnel des transporteurs de chlorure et de sodium trans épithélial spontanément des souris de respiration, ainsi que plusieurs essais chez le même animal tout en réduisant les liées aux tests mortalité.

Introduction

Depuis près de trois décennies, des mesures de différence (DP) potentiels électriques ont été utilisés pour évaluer l’état fonctionnel des transporteurs ioniques transmembranaires exprimée à la muqueuse nasale, comme représentant du distal airways1. Comme une dynamique multipas test2,3, nasal PD permettant une dissection fonctionnelle de la Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) et l’activité de sodium épithélial de canal (ENaC), tous deux localisés dans les membranes apicales de les cellules épithéliales et exercer un rôle important dans l’hydratation de surface des voies aériennes. L’application clinique majeure de l’essai de PD nasale est d’aider au diagnostic des FC, la maladie génétique mortelle plus courante dans les populations caucasiennes avec une fréquence moyenne de 1 sur 2 500 naissances dans les pays européens. Le test s’est avéré bien utile dans le diagnostic des formes oligo – ou mono-symptomatique atténué, FC généralement diagnostiquée plus tard dans la vie et de troubles liés au CF par exemple l’absence bilatérale congénitale des canaux déférents, pancréatite chronique idiopathique, allergique l’aspergillose broncho-pulmonaire et bronchectasie4. Plus récemment, clinometric évaluation de la modulation thérapeutique de la CFTR base défaut5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16 a eu recours à la nasale PD dans les essais cliniques de nouvelles thérapies CF. Dans le paramètre préclinique, l’essai a été adaptée à la souris17 pour permettre l’enquête de la bioactivité des nouveaux CF cible thérapies18,19,20,21. Chez les souris, la technique est délicate, basé sur des différences anatomiques espèces liées à la taille de la région nasale entre les rongeurs et les humains et principalement sur le rôle essentiel des inputs sensoriels de la région de nasofacial chez les rongeurs. Elle exige des opérateurs formés et qualifiés, les équipements dédiés et les fournitures.

CF est une affection multisystémique des glandes exocrines, dans lequel une maladie respiratoire chronique domine le tableau clinique. La maladie est causée par des mutations du gène codant l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc)-régis CFTR chlorure canal22. A ce jour, plus de 2 000 CFTR mutations ont été identifiées23. Le plus commun mutation24,25, dans près de 90 % des allèles CF, correspond à une suppression de la phénylalanine en position 508 de la chaîne polypeptidique de la protéine (F508del-CFTR). La protéine CFTR est un canal chlorure de conductance petit purement ohmique. Il y a aussi des preuves considérables que CFTR régule d’autres mécanismes de transport, en particulier, ENaC26,27. Transport de l’électrolyte défectueux, y compris réduite conductance de chlorure CFTR-dépendante et conductance accrue du sodium ENaC-dépendant, est une caractéristique des épithéliums CF. L’ancien vice se traduit par une repolarisation réduite ou supprimée en réponse à la fois un efflux de chlorure favorisant gradient électrochimique et ajout de l’isoprénaline (un agoniste β-adrénergique qui augmente l’AMPc intracellulaire) ou la forskoline (une adénylate cyclase agoniste non approuvé pour l’usage clinique). Le défaut de ce dernier se traduit par une hyperpolarisation basale de la muqueuse nasale (une duree plus négative) et une réponse accrue à l’amiloride, un diurétique qui bloque l’ENaC28.

Modèles de souris CF ont été fréquemment utilisés dans la recherche de CF et ont été inestimables dans la pathologie de la CF de dissection. De nos jours, au moins quinze modèles ont été décrits29, dont trois sont homozygotes pour les plus cliniquement pertinentes F508del mutation30,31,32. Un de ces trois souches30, développé à l’Université Erasmus de Rotterdam, a été utilisé pendant près de 20 ans dans le laboratoire Université catholique de Louvain (UCL). Le Cftrtm1Eur modèle30 s’est avéré pour être très utile pour étudier la physiopathologie multiviscérale de maladie CF et de tester l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques18,19,20, 21. Plusieurs problèmes peuvent survenir au cours ou au début après (< 24h) le test de PD nasal chez les souris. Dans cet article, nous décrivons la profondeur adéquate de l’anesthésie nécessaire pour garder un cathéter nasal in situ pour perfusion continue et les mesures pour éviter la broncho-aspiration de solutions perfusés dans le nez. Les soins aux animaux à la fin de l’essai estégalement également décrite, notamment l’administration d’une combinaison d’antidotes des médicaments anesthésiques, menant à inverser rapidement l’anesthésie avec une récupération complète des animaux. Au total, ces procédures permettent des mesures fiables en spontanément respiration souris, réduction de la mortalité liées aux tests et recommencer l’essai chez le même animal. Des données représentatives provenant de l’essai de PD nasale dans un CF et une souris de type sauvage sont montrées et discutées.

Le protocole d’essai des PD nasal murin est signalé en trois sessions : évaluation et la gestion avant, pendant et après l’essai. Dans l’évaluation de pré-test et la gestion, le protocole de préparation du cathéter double lumière nasale et des solutions pour perfusion nasale continue est décrit en détail. Au cours de l’évaluation et des portions de la gestion de l’essai, expérimental et la manipulation de la souris est minutieusement disséqué. Enfin, gestion de l’animal à la fin de l’essai est décrite afin d’améliorer la récupération complète animale.

Protocol

Les études et les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique pour la recherche sur les animaux de l’UCL (2017/UCL/MD/015) et en accord avec le règlement de la Communauté européenne pour l’utilisation des animaux en recherche (CEE n° 86/609). Les enquêteurs sont qualifiés pour l’expérimentation animale suite à la Directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010 relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. <p class="jove_title…

Representative Results

Afin d’illustrer les anomalies de transport ionique caractéristique dans les FC, nasale PD mesures ont été effectuées selon le protocole décrit ci-dessus chez une souris F508del-CF et à un contrôle de type sauvage du fond génétique de la colonie de Bruxelles de FVB/129 CFTRtm1Eur souris30. Ce modèle cliniquement pertinent, abritent les plus courantes et un des plus graves F508del-CFTR mutation23,<sup class="…

Discussion

Le but de cet article est de décrire un protocole adéquat pour mesurer des PD nasale sous perfusion continue de solutions spontanément respiration souris pour un laps de temps requis pour contrôler l’intégrité des transporteurs ioniques, principalement CFTR et ENaC. Toutes les étapes du protocole ont été soigneusement optimisés afin d’assurer la récupération complète animale et de bonne qualité et de données reproductibles. En particuliers, critiques des étapes sont anesthésie évaluation et la gesti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient Prof. J. Lebacq pour l’édition critique du manuscrit. CFTRtm1Eur (souris homozygotes de F508del-CFTR (FVB/129) ont été élaborées par le MC Erasmus, Rotterdam, aux Pays-Bas, avec l’appui de l’Action de Coordination européenne Communauté économique européenne pour la recherche en mucoviscidose EU FP6 LHHM-CT-2005-018932.

Materials

Portex polyethylene tube  Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD to prepare capillary tubes for nasal probe
Electrode cream Parker, Fairfield, NJ, USA Redux cream to build electrode bridges
Ag/AgCl electrodes Biomedical, Clinton Township, MI, USA JNS BNT131-1,0 measuring and reference electrodes
amiloride hydrochloride Sigma, St Louis, MI, USA A7410 to prepare perfusion solutions
forskolin Sigma, St Louis, MI, USA F6886 to prepare perfusion solutions
Knick Portamess voltmeter Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany Portavo 904 pH to measure potential difference
Paraly SW 112 Software  Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany Paraly SW112 software to capture potential difference data
midazolam  Mylan, Hoeilaart, Belgium Dormicum 15mg/3ml to serve as anaesthetic premedication
fentanyl Janssen Cilag, Berchem, Belgium Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml to serve as anaesthetic medication
medetomidine Orion Pharma, Espoo, Finland Domitor 1 mg/ml to serve as anaesthetic medication
droperidol  Janssen  Cilag, Berchem, Belgium Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml to serve as anaesthetic medication
clonidine  Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany Catapressan 0.15 mg/ml, to serve as anaesthetic medication
refernce IV catheter Becton Dickinson, Sandy, UT, USA 24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W to build electrode bridges
forceps  Fine science Tools, Heidelberg, Germany Dumont #5, Fine science Tools to place the nasal catheter
naloxone  Braun Medical, Brussels, Belgium Narcan, 0.4 mg/ml to serve as anaesthetic antagonist
atipamezole  Zoetis, Bloomberg, Belgium Antisedan, 5 mg/ml to serve as a medetomedine specific antidote 
Heating pads  Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA 18,8×37,5 cm; 15,5×15,5 cm to avoid hypothermia during and after the test
Peristaltic pump P1 GE Life Sciences, Uppsala, Sweden 18111091 to perfuse solutions in the mouse nose
cyanoacrylate glue Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany  super glue 3 to glue together two capillary tubes  for nasal probe
NaCl Sigma, St Louis, MI, USA RES0926S-A7 Pharma-Grade, USP
CaCl2.2H2O Sigma, St Louis, MI, USA M7304 Pharma-Grade, USP
MgCl2.6H2O Sigma, St Louis, MI, USA 1551128 Pharma-Grade, USP
K2HPO4 Sigma, St Louis, MI, USA 1551139 Pharma-Grade, USP
Na gluconate Sigma, St Louis, MI, USA S2054 Pharma-Grade, USP
Ca gluconate Sigma, St Louis, MI, USA C8231 Pharma-Grade, USP
MgSO4.7H2O Sigma, St Louis, MI, USA RES0089M-A7 Pharma-Grade, USP
BD needle  Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA BD 26G (0.45×10 mm) intraperitoneal injection
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References

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Beka, M., Leal, T. Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice. J. Vis. Exp. (137), e57934, doi:10.3791/57934 (2018).
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