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생물학

Nasale Potentialdifferenz, Trans-epithelialen Ionentransport bei Mäusen zu quantifizieren

Published: July 04, 2018
doi:
10.3791/57934
,
1Louvain Center for Toxicology and Applied Pharmacology (LTAP), Institut de Recherche Expérimentale et Clinique (IREC),Université Catholique de Louvain

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur nasalen Potentialdifferenz bei Mäusen zu messen. Der Test wird die Funktion des transmembranen Ion Transporter wie der Mukoviszidose transmembranen Leitwert Regler und der epithelialen Natrium-Kanal quantifiziert. Es ist wertvoll zur Bewertung der Wirksamkeit neuartiger Therapien für Mukoviszidose.

Abstract

Die nasale potenzielle Unterschied Test wurde seit fast drei Jahrzehnten zur bei der Diagnose der zystischen Fibrose (CF) zu unterstützen. Es hat sich als hilfreich im Falle von gedämpft, Oligo oder Mono-symptomatischen Formen von CF in der Regel später diagnostiziert, und CF-bedingten Erkrankungen wie kongenitale bilaterale Fehlen der Samenleiter, idiopathischer chronischer Pankreatitis, allergische bronchopulmonale Aspergillose und Bronchiektasen. In klinischen und präklinischen Einstellungen wurde der Test verwendet wie ein Biomarker, Antworten auf gezielte therapeutische Strategien für vgl. Anpassung der Test eine Maus zu quantifizieren anspruchsvoll ist und kann einen damit verbundenen Sterblichkeit zur Folge haben. Dieses Papier beschreibt die ausreichende Tiefe der Narkose erforderlich, um einen nasalen Katheter in Situ für kontinuierliche Perfusion. Es werden Maßnahmen zur Vermeidung von Broncho-Aspiration von Lösungen in der Nase durchströmt. Es beschreibt auch die Pflege der Tiere am Ende des Tests, einschließlich Verwaltung aus einer Kombination von Gegenmittel von Anästhetika, rasch die Rücknahme der Narkose mit vollständige Genesung der Tiere führt. Repräsentative Daten aus einem CF und Wildtyp Maus zeigen, dass der Test zwischen CF und nicht-CF unterscheidet. Insgesamt ermöglicht das Protokoll hier beschriebenen zuverlässige Messungen des funktionellen Status von Trans-epithelialen Chlorid und Natrium-Transporter in spontan atmen Mäuse sowie mehrere Tests im gleichen Tier und gleichzeitig Test-bezogene Mortalität.

Introduction

Seit fast drei Jahrzehnten wurden elektrischen möglichen Unterschied (PD) Messungen zur funktionellen Status von transmembranen Ionen-Transporter auf der Nasenschleimhaut, als Vertreter des distalen Airways1ausgedrückt zu bewerten. Wie ein mehrstufiger dynamischer test2,3, Nasal PD ermöglicht funktionale Dissektion der Cystic Fibrosis Transmembrane Leitwert Regulator (CFTR) und epitheliale Natrium-Kanal (ENaC) Aktivität, lokalisiert sowohl an der apikalen Membranen der Epithelzellen und kritische Rollen in Oberfläche Hydratation Atemwege ausübt. Die große klinische Anwendung der nasalen PD-Test ist bei der Diagnose von CF, die häufigste tödliche genetische Störung in den kaukasischen Bevölkerungen mit einer durchschnittlichen Inzidenz der 1 von 2.500 Lebendgeburten in europäischen Ländern zu unterstützen. Der Test hat lange hilfreich bei der Diagnose von abgeschwächten, Oligo oder Mono-symptomatischen Formen von CF in der Regel später diagnostiziert, und CF-bedingten Erkrankungen wie kongenitale bilaterale Fehlen der Samenleiter, idiopathischer chronischer Pankreatitis, allergische bewiesen. bronchopulmonale Aspergillose und Bronchiektasen4. In jüngerer Zeit, clinometric Bewertung der therapeutischen Modulation der grundlegenden CFTR defekt5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16 der nasalen PD in klinischen Studien mit neuen CF-Therapien Gebrauch gemacht hat. In der präklinischen Einstellung wurde der Test die Maus17 Untersuchung des die Bioaktivität der neuen CF Target Therapien18,19,20,21zuzulassen angepasst. Bei Mäusen ist die Technik zarte, basierend auf Art verwandt anatomische Unterschiede in der Größe der nasalen Region zwischen Nagern und Menschen, und vor allem auf die wesentliche Rolle der Sinneseindrücke aus der Nasofacial Region bei Nagetieren. Es erfordert ausgebildete und qualifizierte Betreiber, spezielle Ausrüstungen und Zubehör.

CF ist eine Multi-systemische Erkrankung therapeutisches Drüsen, in denen chronische Erkrankung der Atemwege das klinische Bild dominiert. Die Krankheit wird verursacht durch Mutationen im Gen Kodierung der zyklischen Adenosin Monophosphate (cAMP)-CFTR-Chlorid-Kanal22geregelt. Bis heute wurden mehr als 2.000 CFTR-Mutationen identifiziert23. Die häufigste Mutation24,25, gefunden in fast 90 % der CF-Allele, entspricht eine Deletion von Phenylalanin in Position 508 der Polypeptidkette des Proteins (F508del-CFTR). Das CFTR-Protein ist ein rein ohmschen kleiner Leitwert-Chlorid-Kanal. Außerdem gibt es beträchtlichen Beweis, dass CFTR andere Transportmechanismen, insbesondere ENaC26,27regelt. Defekten Elektrolyt Transport, einschließlich reduzierter CFTR-abhängigen Chlorid Leitwert und erhöhte ENaC-abhängige Natrium Leitwert, ist ein Markenzeichen von CF Epithelien. Der ehemalige defekt spiegelt sich ein reduziert oder abgeschafft Repolarisation als Reaktion auf einen elektrochemischen Gradienten bevorzugen Chlorid Ausfluss und Zugabe von Isoprenalin (einen β-adrenerge Agonisten, die intrazellulären cAMP erhöht) oder Forskolin (eine Adenylat Cyclase-Agonist, nicht für den klinischen Einsatz zugelassen). Der letztere defekt spiegelt sich eine basale Hyperpolarisation der Nasenschleimhaut (ein negativer PD) und eine erhöhte Reaktion auf Amilorid, ein Diuretikum, das ENaC28blockiert.

CF-Maus-Modellen in CF Forschung häufig verwendet worden und wurden bei CF Pathologie sezieren von unschätzbarem Wert. Heute wurden mindestens fünfzehn Modellen beschriebenen29, drei davon homozygot für die klinisch relevanten F508del Mutation30,31,32 sind. Eines dieser drei Sorten30, entwickelt an der Erasmus Universität in Rotterdam, hat seit fast 20 Jahren in der Université Catholique de Louvain (UCL) Labor eingesetzt. Die Cftrtm1Eur Modell30 hat erwies sich als sehr nützlich, die Gewebehypoxie Pathophysiologie der CF-Krankheit zu studieren und testen Sie die Wirksamkeit von neuen therapeutischen Strategien18,19,20, 21. Zahlreiche Probleme können auftreten, während oder nach der frühen (< 24 h) der nasalen PD-Test an Mäusen. In diesem Papier die ausreichende Tiefe der Narkose, Broncho-Aspiration von Lösungen in der Nase durchströmt zu vermeiden halten einen nasalen Katheter in Situ für kontinuierliche Perfusion und Maßnahmen gefordert werden beschrieben. Die Pflege der Tiere am Ende des Tests ist auch beschrieben, einschließlich der Verwaltung aus einer Kombination von Gegenmittel von Anästhetika, rasch die Rücknahme der Narkose mit vollständige Genesung der Tiere führt. Insgesamt können diese Verfahren zuverlässige Messungen in spontan atmen Mäuse, reduzierte Test-Mortalität und Wiederholung des Tests in das gleiche Tier. Repräsentative Daten aus der nasalen PD-Test in eine CF und Wildtyp Maus werden gezeigt und diskutiert.

Das murine nasale PD Testprotokoll wird in drei Sitzungen berichtet: Bewertung und das Management vor, während und nach dem Test. In der Pre-Test-Bewertung und Management wird das Protokoll der Vorbereitung des doppelten Lumen nasale Katheters und Lösungen für kontinuierliche nasale Perfusion verwendet ausführlich beschrieben. Bei der Bewertung und Management Teile des Tests der experimentelle Aufbau und die Handhabung der Maus minutiös seziert. Schließlich ist Management des Tieres am Ende des Tests beschrieben, um die vollständige Tier Erholung zu verbessern.

Protocol

Die Untersuchungen und Verfahren wurden von der Ethikkommission für Tierversuche des UCL (2017/UCL/MD/015) und im Einvernehmen mit der Gesetze der Europäischen Union für Tierversuche in der Forschung (CEE n ° 86/609) genehmigt. Die Ermittler sind für die Tierversuche, die nach der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22. September 2010 zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere geeignet. (1) vor dem test Bewertung und das Management <o…

Representative Results

Um die charakteristischen Ionen-Transport Anomalien in CF zu verdeutlichen, wurden nasale TE-Messungen durchgeführt, nach der oben beschriebenen, in eine F508del-CF-Maus und ein Wildtyp Kontrolle über den FVB/129 genetischen Hintergrund aus der Kolonie Brüssel-Protokolls CFTRtm1Eur Mäuse30. Diese klinisch relevante Modell, beherbergen die häufigste und einer der schwersten F508del-CFTR-Mutation23,…

Discussion

Dieses Papier soll eine angemessene Protokoll zur Messung der nasalen PD unter kontinuierlicher Perfusion der Lösungen in spontan atmen Mäuse auf einer Länge von Zeitaufwand für die Prüfung der Integritätdes der Ionen-Transporter, hauptsächlich CFTR und ENaC beschreiben. Alle Schritte des Protokolls wurden sorgfältig optimiert, um vollständige Tier Erholung und gute Qualität und reproduzierbare Daten zu gewährleisten. In bestimmten, wichtigen Schritte sind Anästhesie Bewertung und Management und adäquate Tie…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Prof. J. Lebacq kritisch bearbeitet das Manuskript. CFTR-tm1Eur (homozygoten F508del-CFTR (FVB/129) Mäuse wurden entwickelt durch die Erasmus MC, Rotterdam, Niederlande, mit Unterstützung der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft Europäische Koordination Aktion für Forschung in der Mukoviszidose EU FP6 LHHM-CT-2005-018932.

Materials

Portex polyethylene tube  Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD to prepare capillary tubes for nasal probe
Electrode cream Parker, Fairfield, NJ, USA Redux cream to build electrode bridges
Ag/AgCl electrodes Biomedical, Clinton Township, MI, USA JNS BNT131-1,0 measuring and reference electrodes
amiloride hydrochloride Sigma, St Louis, MI, USA A7410 to prepare perfusion solutions
forskolin Sigma, St Louis, MI, USA F6886 to prepare perfusion solutions
Knick Portamess voltmeter Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany Portavo 904 pH to measure potential difference
Paraly SW 112 Software  Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany Paraly SW112 software to capture potential difference data
midazolam  Mylan, Hoeilaart, Belgium Dormicum 15mg/3ml to serve as anaesthetic premedication
fentanyl Janssen Cilag, Berchem, Belgium Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml to serve as anaesthetic medication
medetomidine Orion Pharma, Espoo, Finland Domitor 1 mg/ml to serve as anaesthetic medication
droperidol  Janssen  Cilag, Berchem, Belgium Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml to serve as anaesthetic medication
clonidine  Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany Catapressan 0.15 mg/ml, to serve as anaesthetic medication
refernce IV catheter Becton Dickinson, Sandy, UT, USA 24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W to build electrode bridges
forceps  Fine science Tools, Heidelberg, Germany Dumont #5, Fine science Tools to place the nasal catheter
naloxone  Braun Medical, Brussels, Belgium Narcan, 0.4 mg/ml to serve as anaesthetic antagonist
atipamezole  Zoetis, Bloomberg, Belgium Antisedan, 5 mg/ml to serve as a medetomedine specific antidote 
Heating pads  Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA 18,8×37,5 cm; 15,5×15,5 cm to avoid hypothermia during and after the test
Peristaltic pump P1 GE Life Sciences, Uppsala, Sweden 18111091 to perfuse solutions in the mouse nose
cyanoacrylate glue Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany  super glue 3 to glue together two capillary tubes  for nasal probe
NaCl Sigma, St Louis, MI, USA RES0926S-A7 Pharma-Grade, USP
CaCl2.2H2O Sigma, St Louis, MI, USA M7304 Pharma-Grade, USP
MgCl2.6H2O Sigma, St Louis, MI, USA 1551128 Pharma-Grade, USP
K2HPO4 Sigma, St Louis, MI, USA 1551139 Pharma-Grade, USP
Na gluconate Sigma, St Louis, MI, USA S2054 Pharma-Grade, USP
Ca gluconate Sigma, St Louis, MI, USA C8231 Pharma-Grade, USP
MgSO4.7H2O Sigma, St Louis, MI, USA RES0089M-A7 Pharma-Grade, USP
BD needle  Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA BD 26G (0.45×10 mm) intraperitoneal injection
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References

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Beka, M., Leal, T. Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice. J. Vis. Exp. (137), e57934, doi:10.3791/57934 (2018).
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