마우스에 트랜스 상피 이온 수송 계량 비 전위차

Summary

여기, 선물이 쥐에서 코 전위차를 측정 하는 프로토콜. 테스트는 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 및 상피 나트륨 채널 같은 막 횡단 이온 전송기의 기능을 단정. 그것은 낭 성 섬유 증에 대 한 새로운 치료의 효능을 평가 하기 위해 중요 합니다.

Abstract

비 강 잠재적인 차이 테스트 낭 성 섬유 증 (CF)의 진단에 도움을 거의 3 수십 년 동안 사용 되었습니다. 그것은의 경우에 도움이 될 감쇠, 일반적으로 나중에 진단 하는 CF와 CF 관련 장애 vas deferens, 특 발성 만성 췌 장 염, 알레르기의 선 천 성 양측 부재 등의 oligo 또는 모노 증상 형태 입증 bronchopulmonary aspergillosis, 그리고 기관지 확장 증입니다. 임상 및 전 임상 설정에서 테스트로 cf. Adapting 마우스를 테스트에 대 한 타겟된 치료 전략에 대 한 응답을 측정 하는 바이오 마커 도전 이며 관련된 사망률을 수반할 수 있습니다 사용 되었습니다. 이 문서는 비 강 카 테 터에 현장에서 지속적인 관류에 대 한 유지 하는 데 필요한 마 취의 적절 한 깊이 설명 합니다. 그것을 코에 끼얹는다 솔루션의 broncho-열망을 피하기 위해 조치를 나열 합니다. 그것은 또한 빠르게 반전 하는 전체 복구는 동물의 마 취로 이어지는 마 취 약의 해독의 조합의 관리를 포함 하 여 테스트의 끝에서 동물 관리를 설명 합니다. 대표적인 데이터는 CF와 CF와 CF 비 사이 차별 테스트 야생-타입 마우스 쇼에서 가져온. 모두, 여기에 설명 된 프로토콜 신뢰할 수 있는 측정 가능 줄이면서 동일한 동물에 여러 테스트로 서 저절로 호흡 쥐, 트랜스 상피 나트륨과 염화 물 전송기의 기능 상태의 테스트 관련 사망입니다.

Introduction

거의 3 년간 전기 잠재적인 차이 (PD) 측정 원심 항공¹의 대표로 서 비 강 점 막에 표현 하는 막 횡단 이온 전송기의 기능 상태를 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 둘 다의 꼭대기 막에 지역화 다단계 동적 테스트^2,3, 코 PD 수 있습니다 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 (CFTR)과 상피 나트륨 채널 (ENaC) 활동의 기능 해 부 상피 세포 하 고 기도 표면 수 분에 중요 한 역할을 발휘. 비 강 PD 테스트의 주요 임상 응용 프로그램은 CF, 유럽 국가에 1 개 2500 라이브 출생의 평균 발생률과 백인 인구에 있는 가장 일반적인 치명적인 유전 질환의 진단에 도움을. 테스트는 오랫동안 감쇠, oligo 또는 모노 증상 형태 일반적으로 나중에 진단 하는 CF와 CF 관련 장애 vas deferens, 특 발성 만성 췌 장 염, 알레르기의 선 천 성 양측 부재 등의 진단에 도움이 입증 bronchopulmonary aspergillosis, 그리고 기관지 확장 증⁴. 더 최근에, 기본적인 CFTR의 치료 변조의 clinometric 평가^{5,6,7,,89,10,11 결함 ,12,,1314,,1516} 새로운 CF 치료의 임상 시험에서 비 강 PD의 사용 했다. 전 임상 설정에서 테스트 새로운 CF 대상 치료^18,19,,2021의 bioactivity의 조사 수 있도록 마우스¹⁷ 에 적응 되었습니다. 마우스에는 기술은 이다 섬세 한, 설치류와 인간 사이 코 영역의 크기에 종 관련 해 부 차이 설치류에 nasofacial 지역에서 감각 입력의 필수적인 역할에 주로 기반으로. 그것은 훈련 되 고 숙련 된 운영자, 전용된 장비 및 공급을 요구 한다.

CF는 전 샘의 다중 조직 장애는 만성 호흡기 질환에서 임상 그림을 지배 하고있다. 질병은 인코딩 순환 아데노신 monophosphate (캠프) 유전자에 돌연변이 의해 발생-규제 CFTR 염화 물 채널²². 날짜 하려면, 2000 개 이상의 CFTR 돌연변이 발견된²³되었습니다. 가장 일반적인 돌연변이^24,25, CF 대립 유전자의 거의 90%에서 발견 위치 508 (F508del-CFTR) 단백질의 polypeptide 사슬에서에서 페닐알라닌의 삭제에 해당 합니다. CFTR 단백질은 순전히 저항 작은 전도성 염화 물 채널 이다. CFTR 다른 전송 메커니즘, 특히 ENaC^26,27을 조절 하는 상당한 증거가 있다. 결함이 전해질 수송, CFTR 종속 염화 전도도 감소 등 증가 ENaC 종속 나트륨 전도성, CF epithelia의 특징 이다. 전 결함 감소 또는 폐지 repolarization 전기 그라데이션 좋아하는 염화 경과 isoprenaline (는 β-아드레날린 길 항 제는 세포내 cAMP를 증가) 또는 산림 (는 adenylate의 추가에 의해 반영 된다 있고 주 작동 근, 임상 사용을 위해 승인 되지). 후자의 결점은 비 강 점 막 (더 부정적인 PD)와 amiloride, ENaC²⁸을 차단 하는 뇨 제 약물에 대 한 증가 응답의 기저 hyperpolarization에 의해 반영 됩니다.

CF 마우스 모델 자주 CF 연구에 사용 되 고 CF 병 리 해 부에 귀중 한 되었습니다. 요즘, 적어도 15 모델 설명된²⁹, 중 3 개는 되는 가장 임상 관련 F508del 돌연변이^30,,3132homozygous 되었습니다. 이 세³⁰, 로테르 담의 에라스무스 대학에서 개발 중 대학교 catholique 드 루 뱅 (UCL) 실험에서 거의 20 년 동안 사용 되었습니다. Cftr^tm1Eur 모델³⁰ CF 질병의 multiorgan 이상 공부 하 고 새로운 치료 전략^{18,,1920의 효능을 테스트 하는 매우 유용한 것으로 입증 되었습니다. 21}. 동안 또는 후 초기 수많은 문제가 발생할 수 있습니다 (< 24 h) 쥐에서 비 강 PD 테스트. 이 논문에서는, broncho-코에 끼얹는다 솔루션의 포부를 피하는 비 강 카 테 터에 현장에서 지속적인 관류 및 측정값에 대 한 유지에 필요한 마 취의 적절 한 깊이 설명 되어 있습니다. 테스트의 끝에 동물 보호, 빠르게 반전 하는 완전 한 복구는 동물의 마 취로 이어지는 마 취 약물의 해독의 조합의 관리를 포함 하 여 설명 이기도 합니다. 이러한 절차 자발적 호흡 마우스, 감소 테스트 관련 사망률과 같은 동물에 테스트 반복에 신뢰성 높은 측정을 허용 합니다. 비 강 PD 테스트와 야생-타입 마우스는 CF에서에서 가져온 대표적인 데이터는 표시 하 고 논의.

Murine 코 PD 테스트 프로토콜은 3 개의 회의에 보고: 평가 및 관리 하기 전에, 하는 동안, 그리고 테스트 후. 사전 테스트 평가 및 관리, 지속적인 비 강 관류에 대 한 사용 되는 솔루션의 이중 루멘 비 강 카 테 터의 준비의 프로토콜 자세히 설명 되어 있습니다. 평가 시험의 관리 부분 동안 실험 설정 및 마우스의 처리는 일 분 해 부. 마지막으로, 전체 동물 복구를 향상 시키기 위해 테스트의 끝에 동물의 관리를 설명 합니다.

Protocol

연구 및 절차 연구 (시 n ° 86/609)에서 동물 사용에 대 한 유럽 공동체 규정 동의 UCL (2017/UCL/MD/015)의 동물 연구에 대 한 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 조사 지침 2010/63/유럽 유럽의 회의 2010 년 9 월 월 22 일의 위원회의 과학적인 목적을 위해 사용 하는 동물의 보호에 따라 동물 실험에 대 한 정규화 됩니다. 1. 테스트 전 평가 및 관리 더블 루멘 비 강 카 테 터를 준비 합?…

Representative Results

CF에서 특성 이온 수송 이상을 설명 하기 위해 비 강 PD 측정 수행한 다음 위에서 설명한 F508del CF 마우스와의 브뤼셀 식민지의 유전 배경 FVB/129의 야생 유형 제어 프로토콜 Cftrtm1Eur 마우스30. 가장 일반적인 및 가장 심각한 F508del CFTR 돌연변이23,,2425, 중 하나를 품고이 임상 관련 ?…

Discussion

이 문서의 목적은 이온 운송업 자, 주로 CFTR 그리고 ENaC의 무결성을 테스트 하는 데 필요한 시간의 길이 대 한 자발적 호흡 생쥐에서 솔루션의 지속적인 관류에서 비 강 PD를 측정 하기 위한 적절 한 프로토콜을 설명 하는 것입니다. 프로토콜의 모든 단계 완전 동물 복구 및 좋은 품질 및 재현성 데이터도 최적화 되었습니다. 특히, 중요 한 단계는 마 취 평가 및 관리, 그리고 적절 한 동물 위치 그리?…

Materials

Portex polyethylene tube	Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL	Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD	to prepare capillary tubes for nasal probe
Electrode cream	Parker, Fairfield, NJ, USA	Redux cream	to build electrode bridges
Ag/AgCl electrodes	Biomedical, Clinton Township, MI, USA	JNS BNT131-1,0	measuring and reference electrodes
amiloride hydrochloride	Sigma, St Louis, MI, USA	A7410	to prepare perfusion solutions
forskolin	Sigma, St Louis, MI, USA	F6886	to prepare perfusion solutions
Knick Portamess voltmeter	Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany	Portavo 904 pH	to measure potential difference
Paraly SW 112 Software	Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany	Paraly SW112 software	to capture potential difference data
midazolam	Mylan, Hoeilaart, Belgium	Dormicum 15mg/3ml	to serve as anaesthetic premedication
fentanyl	Janssen Cilag, Berchem, Belgium	Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml	to serve as anaesthetic medication
medetomidine	Orion Pharma, Espoo, Finland	Domitor 1 mg/ml	to serve as anaesthetic medication
droperidol	Janssen  Cilag, Berchem, Belgium	Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml	to serve as anaesthetic medication
clonidine	Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany	Catapressan 0.15 mg/ml,	to serve as anaesthetic medication
refernce IV catheter	Becton Dickinson, Sandy, UT, USA	24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W	to build electrode bridges
forceps	Fine science Tools, Heidelberg, Germany	Dumont #5, Fine science Tools	to place the nasal catheter
naloxone	Braun Medical, Brussels, Belgium	Narcan, 0.4 mg/ml	to serve as anaesthetic antagonist
atipamezole	Zoetis, Bloomberg, Belgium	Antisedan, 5 mg/ml	to serve as a medetomedine specific antidote
Heating pads	Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA	18,8×37,5 cm; 15,5×15,5 cm	to avoid hypothermia during and after the test
Peristaltic pump P1	GE Life Sciences, Uppsala, Sweden	18111091	to perfuse solutions in the mouse nose
cyanoacrylate glue	Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany	super glue 3	to glue together two capillary tubes  for nasal probe
NaCl	Sigma, St Louis, MI, USA	RES0926S-A7	Pharma-Grade, USP
CaCl2.2H2O	Sigma, St Louis, MI, USA	M7304	Pharma-Grade, USP
MgCl2.6H2O	Sigma, St Louis, MI, USA	1551128	Pharma-Grade, USP
K2HPO4	Sigma, St Louis, MI, USA	1551139	Pharma-Grade, USP
Na gluconate	Sigma, St Louis, MI, USA	S2054	Pharma-Grade, USP
Ca gluconate	Sigma, St Louis, MI, USA	C8231	Pharma-Grade, USP
MgSO4.7H2O	Sigma, St Louis, MI, USA	RES0089M-A7	Pharma-Grade, USP
BD needle	Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA	BD 26G (0.45×10 mm)	intraperitoneal injection