JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
생물학

Nasal potensiell forskjell å kvantifisere Trans-epitelial Ion Transport i mus

Published: July 04, 2018
doi:
10.3791/57934
,
1Louvain Center for Toxicology and Applied Pharmacology (LTAP), Institut de Recherche Expérimentale et Clinique (IREC),Université Catholique de Louvain

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å måle nasal potensielle forskjellen i mus. Testen kvantifiserer funksjon transmembrane ion transportører som cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator og epithelial natrium kanalen. Det er verdifullt å evaluere effekten av romanen terapi for cystisk fibrose.

Abstract

Nasal potensielle forskjellen testen har blitt brukt i nesten tre tiår for å bistå i diagnostisering av cystisk fibrose (CF). Det har vist seg å være nyttig i tilfeller av dempes, oligo – eller mono-symptomatisk former for CF vanligvis diagnostisert senere i livet, og CF-relaterte lidelser som medfødt bilaterale fravær av vas deferens, idiopatisk kronisk pankreatitt, allergisk bronkopulmonal aspergillose og bronkiektasier. I både kliniske og prekliniske har testen blitt brukt som en biomarkør å kvantifisere Svar å målrettet strategier for jf Adapting testen til en mus er utfordrende og kan medføre en tilknyttet dødelighet. Dette dokumentet beskriver tilstrekkelig dybden av anestesi forpliktet til en nasal kateter i situ for kontinuerlig perfusjon. Den viser tiltak for å unngå broncho-aspirasjon av løsninger parfyme i nesen. Den beskriver også dyr omsorg på slutten av testen, inkludert administrasjon av en kombinasjon av motgift av bedøvende narkotika, fører til raskt snu anestesi med full gjenoppretting av dyrene. Representant data fra en CF og vill-type mus viser at testen diskriminerer mellom CF og ikke-CF. Helt, protokollen beskrevet her kan pålitelig målinger av funksjonell status for trans-epitelial klor og natrium transportører i spontant puste mus, samt flere tester i samme dyr samtidig redusere test-relaterte dødelighet.

Introduction

For nesten tre tiår, har elektriske potensielle forskjellen (PD) målinger blitt brukt til å evaluere funksjonell status transmembrane ion transportører uttrykt på nese mucosa, som representant for den distale airways1. Som en må dynamisk test2,3, nasal PD lar funksjonelle Disseksjon av cystisk fibrose Transmembrane konduktans Regulator (CFTR) og epithelial natrium kanal (ENaC) aktivitet, lokalisert begge på apikale membraner av epitelceller og utøve avgjørende roller i airway overflaten hydration. Den store klinisk anvendelsen av nese PD testen er å bistå i diagnostisering av CF, den vanligste dødelig genetisk lidelsen i kaukasiske populasjoner med en gjennomsnittlig forekomst av 1 av 2500 levendefødte i europeiske land. Testen har lenge vist seg nyttig i diagnostisering av dempes, oligo – eller mono-symptomatisk former for CF vanligvis diagnostisert senere i livet, og CF-relaterte lidelser som medfødt bilaterale fravær av vas deferens, idiopatisk kronisk pankreatitt, allergisk bronkopulmonal aspergillose og bronkiektasier4. Nylig clinometric evaluering av terapeutiske modulering av den grunnleggende CFTR feil5,6,7,8,9,10,11 ,,12,,13,,14,,15,,16 har gjort bruk av nese PD i kliniske forsøk av nye CF terapier. I innstillingen prekliniske har testen blitt tilpasset mus17 tillate undersøkelse av bioactivity nye CF mål terapi18,19,20,21. I mus er teknikken delikat, basert på arter anatomiske forskjeller i størrelse nese regionen mellom gnagere og mennesker, og hovedsakelig på den viktige rollen sensoriske innspill fra nasofacial regionen i gnagere. Det krever trent og dyktig operatører, dedikert utstyr og forsyninger.

CF er en multi systemisk lidelse av exocrine kjertler, i som kronisk luftveissykdom dominerer det kliniske bildet. Sykdommen er forårsaket av mutasjoner i genet koding syklisk adenosin monofosfat (cAMP)-regulert CFTR chloride kanal22. Hittil har mer enn 2000 CFTR mutasjoner vært identifisert23. De vanligste mutasjon24,25, funnet i nesten 90% av CF alleler, tilsvarer en sletting av fenylalanin i posisjon 508 polypeptid kjeden av protein (F508del-CFTR). CFTR protein er en rent ohmsk liten konduktans klorid kanal. Det er også betydelige bevis at CFTR regulerer andre transportmekanismer, spesielt ENaC26,27. Defekt elektrolytt transport, inkludert redusert CFTR-avhengige klorid konduktans og økt ENaC-avhengige natrium ledningsevne, er et kjennetegn på CF epithelia. Tidligere feilen gjenspeiles gjennom en redusert eller avskaffet repolarization svar på både elektrokjemiske gradient favoring klorid middelklasseinnbyggere og tillegg av isoprenaline (en β-adrenerge Agonistiske som øker intracellulær leiren) eller forskolin (en adenylate cyclase Agonistiske, ikke godkjent for klinisk bruk). Den siste feilen gjenspeiles av en basal hyperpolarization av nese mucosa (en mer negativ PD) og en økt respons på amilorid, et vanndrivende stoff som blokkerer ENaC28.

CF musen modeller er ofte brukt i CF forskning og har vært uvurderlig i å dissekere CF patologi. I dag, har minst femten modeller vært beskrevet29, hvorav tre er homozygous den mest klinisk relevante F508del mutasjon30,31,32. En av disse tre påkjenningen30, utviklet ved Erasmus University i Rotterdam, er brukt i nesten 20 år i Université catholique de Louvain (UCL) laboratoriet. Cftrtm1Eur modell30 har vist seg for å være svært nyttig å studere i multiorgan Patofysiologien ved CF sykdommen og å teste effekten av nye strategier18,19,20, 21. Mange problemer kan oppstå under eller tidlig etter (< 24 h) nasal PD testen i mus. I denne utredningen tilstrekkelig dybden av anestesi nødvendig for å holde en nasal kateter i situ for kontinuerlig perfusjon og tiltak for å unngå broncho-aspirasjon av løsninger parfyme i nesen er beskrevet. Dyr omsorg på slutten av testen er også beskrevet, inkludert administrasjon av en kombinasjon av motgift bedøvende stoffer, fører til raskt snu anestesi med fullstendig gjenoppretting av dyrene. Sammen kan disse prosedyrene pålitelig mål i spontant puste mus, redusert dødelighet, test og Gjenta testen i samme dyret. Representant data fra nese PD testen i en CF og vill-type mus vises og diskutert.

Murine nasal PD testprotokollen rapporteres i tre økter: vurdering og ledelse før, under og etter testen. For pre-test for vurdering og styring, er protokollen for utarbeidelsen av den doble lumen nasal kateter og løsninger brukes for kontinuerlig nasal perfusjon beskrevet i detalj. Under vurdering og ledelse deler av testen, er eksperimentelle oppsett og håndtering av musen minuttbasis dissekert. Til slutt, behandling av dyr på slutten av testen er beskrevet for å forbedre full dyr utvinning.

Protocol

Studier og prosedyrer ble godkjent av den etiske komiteen for Forsøksdyrutvalget UCL (2017/UCL/MD/015) og med EU regelverket for dyr bruk i forskning (CEE n ° 86/609). Etterforskerne er kvalifisert for dyr eksperimentering etter direktivet 2010/63/EU av Europaparlamentet og Rådet for 22 September 2010 på beskyttelse av dyr som brukes til vitenskaplige formål. 1. pre test vurdering og ledelse Forberede den doble lumen nasal kateter.Merk: En nasal kateter er laget som en dobbe…

Representative Results

For å illustrere de karakteristiske ion transport unormalt i CF, ble nasal PD målinger utført følger protokollen beskrevet ovenfor i en F508del-CF mus og en vill-type kontroll av FVB/129 genetisk bakgrunn fra Brussel kolonien Cftrtm1Eur mus30. Dette klinisk relevante modell, skjuler de vanligste og en av de mest alvorlige F508del-CFTR mutasjon23,24,25, er be…

Discussion

Formålet med dette dokumentet er å beskrive en tilstrekkelig protokoll for å måle nasal PD under kontinuerlig perfusjon av løsninger i spontant puste mus for lang tid som kreves for å teste integriteten til ion transportører, hovedsakelig CFTR og ENaC. Alle trinn av protokollen har nøye blitt optimalisert for å sikre full dyr og god kvalitet og reproduserbar. I særdeleshet, kritisk trinn er ledelse og anestesi vurdering, og tilstrekkelig dyr posisjon under og etter testen.

Tidligere …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne takker Prof J. Lebacq for kritisk redigering manuskriptet. Cftrtm1Eur (homozygous F508del-CFTR (FVB/129) mus ble utviklet av Erasmus MC, Rotterdam i Nederland, med støtte fra det europeiske fellesskap europeiske koordinering handling for forskning i cystisk fibrose EU FP6 LHHM-CT-2005-018932.

Materials

Portex polyethylene tube  Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD to prepare capillary tubes for nasal probe
Electrode cream Parker, Fairfield, NJ, USA Redux cream to build electrode bridges
Ag/AgCl electrodes Biomedical, Clinton Township, MI, USA JNS BNT131-1,0 measuring and reference electrodes
amiloride hydrochloride Sigma, St Louis, MI, USA A7410 to prepare perfusion solutions
forskolin Sigma, St Louis, MI, USA F6886 to prepare perfusion solutions
Knick Portamess voltmeter Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany Portavo 904 pH to measure potential difference
Paraly SW 112 Software  Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany Paraly SW112 software to capture potential difference data
midazolam  Mylan, Hoeilaart, Belgium Dormicum 15mg/3ml to serve as anaesthetic premedication
fentanyl Janssen Cilag, Berchem, Belgium Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml to serve as anaesthetic medication
medetomidine Orion Pharma, Espoo, Finland Domitor 1 mg/ml to serve as anaesthetic medication
droperidol  Janssen  Cilag, Berchem, Belgium Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml to serve as anaesthetic medication
clonidine  Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany Catapressan 0.15 mg/ml, to serve as anaesthetic medication
refernce IV catheter Becton Dickinson, Sandy, UT, USA 24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W to build electrode bridges
forceps  Fine science Tools, Heidelberg, Germany Dumont #5, Fine science Tools to place the nasal catheter
naloxone  Braun Medical, Brussels, Belgium Narcan, 0.4 mg/ml to serve as anaesthetic antagonist
atipamezole  Zoetis, Bloomberg, Belgium Antisedan, 5 mg/ml to serve as a medetomedine specific antidote 
Heating pads  Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA 18,8×37,5 cm; 15,5×15,5 cm to avoid hypothermia during and after the test
Peristaltic pump P1 GE Life Sciences, Uppsala, Sweden 18111091 to perfuse solutions in the mouse nose
cyanoacrylate glue Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany  super glue 3 to glue together two capillary tubes  for nasal probe
NaCl Sigma, St Louis, MI, USA RES0926S-A7 Pharma-Grade, USP
CaCl2.2H2O Sigma, St Louis, MI, USA M7304 Pharma-Grade, USP
MgCl2.6H2O Sigma, St Louis, MI, USA 1551128 Pharma-Grade, USP
K2HPO4 Sigma, St Louis, MI, USA 1551139 Pharma-Grade, USP
Na gluconate Sigma, St Louis, MI, USA S2054 Pharma-Grade, USP
Ca gluconate Sigma, St Louis, MI, USA C8231 Pharma-Grade, USP
MgSO4.7H2O Sigma, St Louis, MI, USA RES0089M-A7 Pharma-Grade, USP
BD needle  Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA BD 26G (0.45×10 mm) intraperitoneal injection
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knowles, M., Gatzy, J., Boucher, R. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in cystic fibrosis. New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1495 (1981).
  2. Middleton, P. G., Geddes, D. M., Alton, E. F. W. Protocols for in vivo measurement of the ion transport defects in cystic fibrosis nasal epithelium. European Respiratory Journal. 7 (11), 2050-2056 (1994).
  3. Knowles, M. R., Paradiso, A. M., Boucher, R. C. In vivo nasal potential difference: techniques and protocols for assessing efficacy of gene transfer in cystic fibrosis. Human Gene Therapy. 6 (4), 445-455 (1995).
  4. Paranjape, S. M., Zeitlin, P. L. Atypical cystic fibrosis and CFTR-related disorders. Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 35 (3), 116-123 (2008).
  5. Wilschanski, M., et al. A pilot study of the effect of gentamicin on nasal potential difference measurements in CF patients carrying stop mutations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (3), 860-865 (2000).
  6. Clancy, J. P., et al. Evidence that systemic gentamicin suppresses premature stop mutations in patients with CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163 (7), 1683-1692 (2001).
  7. Wilschanski, M., et al. Gentamicin-induced correction of CFTR function in patients with CF and CFTR stop mutations. New England Journal of Medicine. 349 (15), 1433-1441 (2003).
  8. Sermet-Gaudelus, I., et al. In vitro prediction of stop-codon suppression by intravenous gentamicin in patients with CF: a pilot study. BMC Medicine. 5, 5 (2007).
  9. Clancy, J. P., et al. No detectable improvements in CF transmembrane conductance regulator by nasal aminoglycosides in patients with CF with stop mutations. American Journal of Respiratory and Cell Molecular Biology. 37 (1), 57-66 (2007).
  10. Kerem, E., et al. Effectiveness of PTC124 treatment of CF caused by nonsensemutations: a prospective phase II trial. Lancet. 372 (9640), 719-727 (2008).
  11. Sermet-Gaudelus, I., et al. Ataluren (PTC124) induces CF transmembrane conductance regulator protein expression and activity in children with nonsense mutation CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (10), 1262-1272 (2010).
  12. Wilschanski, M., et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 38 (1), 59-69 (2011).
  13. Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with CF and the G551D-CFTR mutation. New England Journal of Medicine. 363 (21), 1991-2003 (2010).
  14. Clancy, J. P., et al. Results of a phase IIa study of VX-809, an investigational CFTR corrector compound, in subjects with cystic fibrosis homozygous for the F508del-CFTR mutation. Thorax. 67 (1), 12-18 (2012).
  15. Leonard, A., Lebecque, P., Dingemanse, J., Leal, T. A randomized placebo-controlled trial of miglustat in cystic fibrosis based on nasal potential difference. Journal of Cystic Fibrosis. 11 (3), 231-236 (2012).
  16. De Boeck, K., et al. CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate end-point. European Respiratory Journal. 41, 203-216 (2013).
  17. Leal, T., et al. Successful protocol of anaesthesia for measuring transepithelial nasal potential difference in spontaneously breathing mice. Laboratory Animals. 40 (1), 43-52 (2006).
  18. Lubamba, B., et al. Preclinical evidence that sildenafil and vardenafil activate chloride transport in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (5), 506-515 (2008).
  19. Lubamba, B., et al. Airway delivery of low-dose miglustat normalizes nasal potential difference in F508del cystic fibrosis mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (11), 1022-1028 (2009).
  20. Lubamba, B., et al. Inhaled PDE5 inhibitors restore chloride transport in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 37 (1), 72-78 (2011).
  21. Vidovic, D., et al. rAAV-CFTRΔR Rescues the Cystic Fibrosis Phenotype in Human Intestinal Organoids and Cystic Fibrosis Mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 288-298 (2016).
  22. Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
  23. Lubamba, B., Dhooghe, B., Noel, S., Leal, T. Cystic fibrosis: insight into CFTR pathophysiology and pharmacotherapy. Clinical Biochemistry. 45 (15), 1132-1144 (2012).
  24. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
  25. Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4925), 1066-1073 (1989).
  26. Stutts, M. J., Rossier, B. C., Boucher, R. C. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inverts protein kinase A-mediated regulation of epithelial sodium channel single channel kinetics. Journal of Biological Chemistry. 272 (22), 14037-14040 (1997).
  27. Ismailov, I. I., et al. Regulation of epithelial sodium channels by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biological Chemistry. 271 (9), 4725-4732 (1996).
  28. Althaus, M. ENaC inhibitors and airway re-hydration in cystic fibrosis: state of the art. Current Molecular Pharmacology. 6 (1), 3-12 (2013).
  29. Wilke, M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, 152-171 (2011).
  30. Van Doorninck, J. H., et al. A mouse model for the cystic fibrosis delta F508 mutation. The EMBO Journal. 14 (18), 4403-4411 (1995).
  31. Colledge, W. H., et al. Generation and characterization of a delta F508 cystic fibrosis mouse model. Nature Genetics. 10 (4), 445-452 (1995).
  32. Zeiher, B. G., et al. A mouse model for the delta F508 allele of cystic fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 96 (4), 2051-2064 (1995).
  33. Ghosal, S., Taylor, C. J., McGray, J. Modification of the nasal membrane potential difference with inhaled amiloride and loperamide in the cystic fibrosis (CF) mouse. Thorax. 51 (12), 1229-1232 (1996).
  34. Ghosal, S., Taylor, C. J., Colledge, W. H., Ratcliff, R., Evans, M. J. Sodium channel blockers and uridine triphosphate: effects on nasal potential difference in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 15 (1), 146-150 (2000).
  35. Leonard, A., et al. Comparative Variability of Nasal Potential Difference Measurements in Human and Mice. Open Journal of Respiratory Disease. 2, 43-56 (2012).
  36. Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch’s 3Rs then and now: the need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
  37. Pritchett-Corning, K. R., et al. AALAS/FELASA Working Group on Health Monitoring of rodents for animal transfer. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 633-640 (2014).
  38. Salinas, D. B., et al. CFTR involvement in nasal potential differences in mice and pigs studied using a thiazolidinone CFTR inhibitor. American Journal of Physiology. Lung Cell Molecular Physiology. 287 (5), 936-943 (2004).
  39. Fisher, J. T., et al. Comparative processing and function of human and ferret cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Journal of Biological Chemistry. 287 (26), 21673-21685 (2012).
  40. Kaza, N., et al. Use of ferrets for electrophysiologic monitoring of ion transport. PLoS One. 12 (10), 0186984 (2017).
  41. Leal, T., Beka, M., Panin, N., Mall, M. A., Noel, S. Nasal potential difference in βENaC-overexpressing mouse reveals pH-sensitive channel hyperactivity and shift of subunits stoichiometry. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (S1), 72 (2017).
  42. Mall, M., Grubb, B. R., Harkema, J. R., O’Neal, W. K., Boucher, R. C. Increased airway epithelial Na+ absorption produces cystic fibrosis-like lung disease in mice. Nature Medicine. 10 (5), 487-493 (2004).
  43. Shah, V. S., et al. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice. Science. 351 (6272), 503-507 (2016).

Tags

Nasal Potential DifferenceCystic FibrosisTransgenic MiceIon TransportDouble Lumen Nasal CatheterElectrolyte CreamVoltmeterPeristaltic PumpData Capture Software
check_url/kr/57934?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Beka, M., Leal, T. Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice. J. Vis. Exp. (137), e57934, doi:10.3791/57934 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image