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생물학

Diferença de potencial nasal para quantificar o transporte do íon Trans-epitelial em ratos

Published: July 04, 2018
doi:
10.3791/57934
,
1Louvain Center for Toxicology and Applied Pharmacology (LTAP), Institut de Recherche Expérimentale et Clinique (IREC),Université Catholique de Louvain

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para medir a diferença de potencial nasal em ratos. O teste quantifica a função de transportadores transmembrana de íons como o regulador de condutância transmembranar de fibrose cística e o canal de sódio epitelial. É valioso para avaliar a eficácia de novas terapias para a fibrose cística.

Abstract

O teste de diferença de potencial nasal tem sido usado por quase três décadas para auxiliar no diagnóstico de fibrose cística (CF). Provou ser útil em casos de atenuado, oligo – ou mono-sintomática formas de CF geralmente diagnosticados mais tarde na vida e de distúrbios relacionados com a CF, tais como ausência bilateral congênita de deferente, pancreatite crónica idiopática, alérgica aspergilose broncopulmonar e bronquiectasias. Em contextos clínicos e pré-clínicos, o teste tem sido utilizado como um biomarcador para quantificar respostas para estratégias terapêuticas específicas para adaptação cf. o teste de um rato é um desafio e pode acarretar uma mortalidade associada. Este paper descreve a profundidade adequada de anestesia necessária para manter um cateter nasal em situ para perfusão contínua. Ele enumera as medidas para evitar Bronco-aspiração de soluções perfundidos no nariz. Ele também descreve o cuidado animal no final do teste, incluindo a administração de uma combinação de antídotos das drogas anestésicas, levando a inverter rapidamente a anestesia com recuperação total dos animais. Dados representativos obtidos de um CF e um rato selvagem-tipo mostram que o teste discrimina entre CF e não-CF. No total, o protocolo descrito aqui permite medições correctas do estatuto funcional de trans-epitelial transportadores de cloreto e sódio em ratos de respirar espontaneamente, bem como vários testes no mesmo animal reduzindo relacionados ao teste mortalidade.

Introduction

Há quase três décadas, utilizaram-se medições elétricas de diferença (PD) potencial para avaliar o estado funcional de transportadores de íons transmembrana expressado na mucosa nasal, como representante das vias aéreas distais1. Como uma dinâmica multipasso teste2,3, nasal PD permite funcional dissecação de fibrose cística regulador de condutância transmembrana (CFTR) e atividade de sódio epitelial canal (ENaC), ambos localizados na membrana apical as células epiteliais e exercendo cargos críticos na superfície hidratação das vias aéreas. A principal aplicação clínica do teste PD nasal é auxiliar no diagnóstico da CF, a doença genética fatal mais comum em populações caucasianas com uma incidência média de 1 de 2.500 nascidos vivos em países europeus. O teste de tempo revelou-se útil no diagnóstico das formas oligo – ou mono-sintomática atenuada, da CF, geralmente diagnosticados mais tarde na vida e de distúrbios relacionados com a CF, tais como ausência bilateral congênita de deferente, pancreatite crónica idiopática, alérgica aspergilose broncopulmonar e bronquiectasias4. Mais recentemente, clinometric avaliação de modulação terapêutica do CFTR básico defeito5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16 tem feito uso do PD nasal em ensaios clínicos de novas terapias de CF. Na configuração de pré-clínicos, o teste foi adaptado para o rato17 para permitir a investigação da Bioatividade da nova CF terapias alvo18,19,20,21. Em camundongos, a técnica é delicada, com base em espécies relacionadas com diferenças anatômicas no tamanho da região nasal entre roedores e seres humanos e principalmente sobre o papel essencial de entradas sensoriais da região nasofacial em roedores. Requer operadores treinados e qualificados, equipamentos e suprimentos.

CF é uma desordem sistêmica múltipla das glândulas exócrinas, na qual doença respiratória crônica domina o quadro clínico. A doença é causada por mutações no gene da codificação do adenosina monofosfato cíclica (cAMP)-regulamentado CFTR cloreto canal22. Até à data, mais de 2.000 mutações CFTR foram identificados23. O mais comum mutação24,25, encontrado em quase 90% dos alelos CF, corresponde a uma exclusão da fenilalanina na posição 508 da corrente do polypeptide da proteína (F508del-CFTR). A proteína CFTR é um canal de cloreto puramente ôhmica da condutibilidade. Também há evidência considerável que CFTR regula outros mecanismos de transporte, em particular, ENaC26,27. Transporte de eletrólito defeituosos, incluindo a condutância de cloreto CFTR-dependente reduzida e maior condutância de sódio ENaC-dependente, é uma característica dos epitélios CF. O antigo defeito é refletido por uma repolarização reduzida ou abolida em resposta a um eletroquímico efluxo favorecendo gradiente de cloreto e a adição de isoproterenol (β-adrenérgico agonista que aumenta cAMP intracelular) ou forskolin (um adenilato ciclase agonista, não aprovada para uso clínico). O último defeito é refletido por uma hiperpolarização basal da mucosa nasal (um PD mais negativa) e uma resposta aumentada a amilorida, um medicamento diurético que bloqueia ENaC28.

Modelos de rato CF têm sido frequentemente utilizados na investigação de CF e tem sido inestimáveis em dissecando patologia CF. Hoje em dia, pelo menos quinze modelos têm sido descritos29, três dos quais são homozigotos para a mutação F508del mais clinicamente relevantes30,31,32. Dentre estes três estirpes30, desenvolvido na Universidade de Erasmus em Roterdão, tem sido usado por quase 20 anos no laboratório Université catholique de Louvain (UCL). O modelo detm1Eur de Cftr30 provou para ser muito útil para estudar a dysregulation fisiopatologia da doença CF e para testar a eficácia de novas estratégias terapêuticas18,19,20, 21. Inúmeros problemas podem ocorrer durante ou início após (< 24h) o teste de PD nasal em ratos. Neste trabalho, são descritos a profundidade adequada de anestesia necessária para manter um cateter nasal em situ para perfusão contínua e medidas para evitar Bronco-aspiração de soluções perfundidos no nariz. O cuidado animal no final do teste também é descrito, incluindo a administração de uma combinação de antídotos de drogas anestésicas, levando a inverter rapidamente a anestesia com completa recuperação dos animais. No total, estes procedimentos permitem medições correctas em ratos de respirar espontaneamente, reduzida mortalidade relacionados ao teste e repetir o teste no mesmo animal. Obtidos a partir do teste de PD nasal em um CF e em um rato selvagem-tipo de dados representativos são mostrados e discutidos.

O protocolo de teste PD nasal murino é relatado em três sessões: avaliação e gestão antes, durante e depois do teste. No pré-teste avaliação e gestão, o protocolo de preparação do cateter de lúmen duplo nasal e de soluções usadas para perfusão nasal contínua é descrito em detalhes. Durante a avaliação e gestão porções do teste, a instalação experimental e a manipulação do mouse é minuciosamente dissecado. Finalmente, a gestão do animal no final do teste é descrito para melhorar a recuperação total de animais.

Protocol

Os estudos e procedimentos foram aprovados pelo Comitê de ética para pesquisas com animais da UCL (2017/UCL/MD/015) e de acordo com as normas da Comunidade Europeia para uso de animais na pesquisa (CEE n º 86/609). Os investigadores estão qualificados para a experimentação animal, seguindo a Directiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho, de 22 de setembro de 2010, relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos. 1. pré-teste de avaliação e gestão <o…

Representative Results

A fim de ilustrar as anomalias de transporte do íon característico em CF, foram realizadas medidas de PD nasais seguindo o protocolo descrito acima em um rato F508del-CF e um controle do tipo selvagem do fundo genético FVB/129 da colônia de Bruxelas CFTRtm1Eur ratos30. Este modelo clinicamente relevante, abrigando um dos mais graves F508del-CFTR mutação23,24,25<…

Discussion

O objetivo deste trabalho é descrever um protocolo adequado para medição PD nasal sob perfusão contínua de soluções em espontaneamente ratos de respirar por um período de tempo necessário para testar a integridade dos transportadores de íons, principalmente CFTR e ENaC. Todas as etapas do protocolo foram cuidadosamente otimizadas para garantir a recuperação completa de animais e de boa qualidade e de dados podem ser reproduzidos. Em particulares, a críticos passos são avaliação de anestesia e de gestão e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores Agradecemos a Prof J. Lebacq edição criticamente o manuscrito. CFTRtm1Eur (homozigotos ratos F508del-CFTR (FVB/129) foram desenvolvidos por Erasmus MC, Rotterdam, Países Baixos, com o apoio da Comunidade Económica Europeia acção de Coordenação Europeia para a investigação no 6º PQ UE de fibrose cística LHHM-CT-2005-018932.

Materials

Portex polyethylene tube  Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD to prepare capillary tubes for nasal probe
Electrode cream Parker, Fairfield, NJ, USA Redux cream to build electrode bridges
Ag/AgCl electrodes Biomedical, Clinton Township, MI, USA JNS BNT131-1,0 measuring and reference electrodes
amiloride hydrochloride Sigma, St Louis, MI, USA A7410 to prepare perfusion solutions
forskolin Sigma, St Louis, MI, USA F6886 to prepare perfusion solutions
Knick Portamess voltmeter Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany Portavo 904 pH to measure potential difference
Paraly SW 112 Software  Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany Paraly SW112 software to capture potential difference data
midazolam  Mylan, Hoeilaart, Belgium Dormicum 15mg/3ml to serve as anaesthetic premedication
fentanyl Janssen Cilag, Berchem, Belgium Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml to serve as anaesthetic medication
medetomidine Orion Pharma, Espoo, Finland Domitor 1 mg/ml to serve as anaesthetic medication
droperidol  Janssen  Cilag, Berchem, Belgium Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml to serve as anaesthetic medication
clonidine  Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany Catapressan 0.15 mg/ml, to serve as anaesthetic medication
refernce IV catheter Becton Dickinson, Sandy, UT, USA 24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W to build electrode bridges
forceps  Fine science Tools, Heidelberg, Germany Dumont #5, Fine science Tools to place the nasal catheter
naloxone  Braun Medical, Brussels, Belgium Narcan, 0.4 mg/ml to serve as anaesthetic antagonist
atipamezole  Zoetis, Bloomberg, Belgium Antisedan, 5 mg/ml to serve as a medetomedine specific antidote 
Heating pads  Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA 18,8×37,5 cm; 15,5×15,5 cm to avoid hypothermia during and after the test
Peristaltic pump P1 GE Life Sciences, Uppsala, Sweden 18111091 to perfuse solutions in the mouse nose
cyanoacrylate glue Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany  super glue 3 to glue together two capillary tubes  for nasal probe
NaCl Sigma, St Louis, MI, USA RES0926S-A7 Pharma-Grade, USP
CaCl2.2H2O Sigma, St Louis, MI, USA M7304 Pharma-Grade, USP
MgCl2.6H2O Sigma, St Louis, MI, USA 1551128 Pharma-Grade, USP
K2HPO4 Sigma, St Louis, MI, USA 1551139 Pharma-Grade, USP
Na gluconate Sigma, St Louis, MI, USA S2054 Pharma-Grade, USP
Ca gluconate Sigma, St Louis, MI, USA C8231 Pharma-Grade, USP
MgSO4.7H2O Sigma, St Louis, MI, USA RES0089M-A7 Pharma-Grade, USP
BD needle  Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA BD 26G (0.45×10 mm) intraperitoneal injection
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References

  1. Knowles, M., Gatzy, J., Boucher, R. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in cystic fibrosis. New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1495 (1981).
  2. Middleton, P. G., Geddes, D. M., Alton, E. F. W. Protocols for in vivo measurement of the ion transport defects in cystic fibrosis nasal epithelium. European Respiratory Journal. 7 (11), 2050-2056 (1994).
  3. Knowles, M. R., Paradiso, A. M., Boucher, R. C. In vivo nasal potential difference: techniques and protocols for assessing efficacy of gene transfer in cystic fibrosis. Human Gene Therapy. 6 (4), 445-455 (1995).
  4. Paranjape, S. M., Zeitlin, P. L. Atypical cystic fibrosis and CFTR-related disorders. Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 35 (3), 116-123 (2008).
  5. Wilschanski, M., et al. A pilot study of the effect of gentamicin on nasal potential difference measurements in CF patients carrying stop mutations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (3), 860-865 (2000).
  6. Clancy, J. P., et al. Evidence that systemic gentamicin suppresses premature stop mutations in patients with CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163 (7), 1683-1692 (2001).
  7. Wilschanski, M., et al. Gentamicin-induced correction of CFTR function in patients with CF and CFTR stop mutations. New England Journal of Medicine. 349 (15), 1433-1441 (2003).
  8. Sermet-Gaudelus, I., et al. In vitro prediction of stop-codon suppression by intravenous gentamicin in patients with CF: a pilot study. BMC Medicine. 5, 5 (2007).
  9. Clancy, J. P., et al. No detectable improvements in CF transmembrane conductance regulator by nasal aminoglycosides in patients with CF with stop mutations. American Journal of Respiratory and Cell Molecular Biology. 37 (1), 57-66 (2007).
  10. Kerem, E., et al. Effectiveness of PTC124 treatment of CF caused by nonsensemutations: a prospective phase II trial. Lancet. 372 (9640), 719-727 (2008).
  11. Sermet-Gaudelus, I., et al. Ataluren (PTC124) induces CF transmembrane conductance regulator protein expression and activity in children with nonsense mutation CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (10), 1262-1272 (2010).
  12. Wilschanski, M., et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 38 (1), 59-69 (2011).
  13. Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with CF and the G551D-CFTR mutation. New England Journal of Medicine. 363 (21), 1991-2003 (2010).
  14. Clancy, J. P., et al. Results of a phase IIa study of VX-809, an investigational CFTR corrector compound, in subjects with cystic fibrosis homozygous for the F508del-CFTR mutation. Thorax. 67 (1), 12-18 (2012).
  15. Leonard, A., Lebecque, P., Dingemanse, J., Leal, T. A randomized placebo-controlled trial of miglustat in cystic fibrosis based on nasal potential difference. Journal of Cystic Fibrosis. 11 (3), 231-236 (2012).
  16. De Boeck, K., et al. CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate end-point. European Respiratory Journal. 41, 203-216 (2013).
  17. Leal, T., et al. Successful protocol of anaesthesia for measuring transepithelial nasal potential difference in spontaneously breathing mice. Laboratory Animals. 40 (1), 43-52 (2006).
  18. Lubamba, B., et al. Preclinical evidence that sildenafil and vardenafil activate chloride transport in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (5), 506-515 (2008).
  19. Lubamba, B., et al. Airway delivery of low-dose miglustat normalizes nasal potential difference in F508del cystic fibrosis mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (11), 1022-1028 (2009).
  20. Lubamba, B., et al. Inhaled PDE5 inhibitors restore chloride transport in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 37 (1), 72-78 (2011).
  21. Vidovic, D., et al. rAAV-CFTRΔR Rescues the Cystic Fibrosis Phenotype in Human Intestinal Organoids and Cystic Fibrosis Mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 288-298 (2016).
  22. Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
  23. Lubamba, B., Dhooghe, B., Noel, S., Leal, T. Cystic fibrosis: insight into CFTR pathophysiology and pharmacotherapy. Clinical Biochemistry. 45 (15), 1132-1144 (2012).
  24. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
  25. Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4925), 1066-1073 (1989).
  26. Stutts, M. J., Rossier, B. C., Boucher, R. C. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inverts protein kinase A-mediated regulation of epithelial sodium channel single channel kinetics. Journal of Biological Chemistry. 272 (22), 14037-14040 (1997).
  27. Ismailov, I. I., et al. Regulation of epithelial sodium channels by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biological Chemistry. 271 (9), 4725-4732 (1996).
  28. Althaus, M. ENaC inhibitors and airway re-hydration in cystic fibrosis: state of the art. Current Molecular Pharmacology. 6 (1), 3-12 (2013).
  29. Wilke, M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, 152-171 (2011).
  30. Van Doorninck, J. H., et al. A mouse model for the cystic fibrosis delta F508 mutation. The EMBO Journal. 14 (18), 4403-4411 (1995).
  31. Colledge, W. H., et al. Generation and characterization of a delta F508 cystic fibrosis mouse model. Nature Genetics. 10 (4), 445-452 (1995).
  32. Zeiher, B. G., et al. A mouse model for the delta F508 allele of cystic fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 96 (4), 2051-2064 (1995).
  33. Ghosal, S., Taylor, C. J., McGray, J. Modification of the nasal membrane potential difference with inhaled amiloride and loperamide in the cystic fibrosis (CF) mouse. Thorax. 51 (12), 1229-1232 (1996).
  34. Ghosal, S., Taylor, C. J., Colledge, W. H., Ratcliff, R., Evans, M. J. Sodium channel blockers and uridine triphosphate: effects on nasal potential difference in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 15 (1), 146-150 (2000).
  35. Leonard, A., et al. Comparative Variability of Nasal Potential Difference Measurements in Human and Mice. Open Journal of Respiratory Disease. 2, 43-56 (2012).
  36. Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch’s 3Rs then and now: the need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
  37. Pritchett-Corning, K. R., et al. AALAS/FELASA Working Group on Health Monitoring of rodents for animal transfer. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 633-640 (2014).
  38. Salinas, D. B., et al. CFTR involvement in nasal potential differences in mice and pigs studied using a thiazolidinone CFTR inhibitor. American Journal of Physiology. Lung Cell Molecular Physiology. 287 (5), 936-943 (2004).
  39. Fisher, J. T., et al. Comparative processing and function of human and ferret cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Journal of Biological Chemistry. 287 (26), 21673-21685 (2012).
  40. Kaza, N., et al. Use of ferrets for electrophysiologic monitoring of ion transport. PLoS One. 12 (10), 0186984 (2017).
  41. Leal, T., Beka, M., Panin, N., Mall, M. A., Noel, S. Nasal potential difference in βENaC-overexpressing mouse reveals pH-sensitive channel hyperactivity and shift of subunits stoichiometry. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (S1), 72 (2017).
  42. Mall, M., Grubb, B. R., Harkema, J. R., O’Neal, W. K., Boucher, R. C. Increased airway epithelial Na+ absorption produces cystic fibrosis-like lung disease in mice. Nature Medicine. 10 (5), 487-493 (2004).
  43. Shah, V. S., et al. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice. Science. 351 (6272), 503-507 (2016).

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Beka, M., Leal, T. Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice. J. Vis. Exp. (137), e57934, doi:10.3791/57934 (2018).
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