Diferencia de potencial nasal para cuantificar el transporte de iones Trans epitelial en ratones
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para medir diferencia de potencial nasal en ratones. La prueba cuantifica la función de transportadores transmembrana de iones tales como el regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis quística y el canal epitelial del sodio. Es valioso para evaluar la eficacia de nuevas terapias para la fibrosis quística.
Abstract
La prueba de diferencia de potencial nasal se ha utilizado durante casi tres décadas para ayudar en el diagnóstico de fibrosis quística (FQ). Ha demostrado ser útil en casos de atenuados, formas oligo o mono sintomática de la FQ se diagnostican generalmente más tarde en la vida y de trastornos relacionados con la CF como ausencia bilateral congénita de conductos deferentes, la pancreatitis crónica idiopática, alérgica aspergilosis broncopulmonar y bronquiectasia. En ajustes clínicos y preclínicos, la prueba se ha utilizado como un biomarcador para cuantificar las respuestas a estrategias terapéuticas específicas para CF. adaptar el test a un ratón es difícil y puede exigir una mortalidad asociada. Este papel describe la adecuada profundidad de la anestesia necesaria para mantener un catéter nasal en situ para perfusión continua. Listas las medidas para evitar la Bronco-aspiración de soluciones de perfusión en la nariz. También describe el cuidado de los animales al final de la prueba, incluyendo la administración de una combinación de los antídotos de los fármacos anestésicos, a revertir rápidamente la anestesia con la recuperación completa de los animales. Datos representativos de un CF y un ratón de tipo salvaje muestran que la prueba discrimina entre CF y CF no. En conjunto, el protocolo descrito aquí permite mediciones fiables de la situación funcional de transportadores trans epitelial de cloruro y sodio en ratones de respirar espontáneamente, así como varias pruebas en el mismo animal reduciendo el relacionado con la prueba mortalidad.
Introduction
Durante casi tres décadas, se han utilizado mediciones potenciales eléctricas de la diferencia (PD) para evaluar el estado funcional de los transportadores de iones transmembrana expresada en la mucosa nasal, como representante de la de las vías aéreas distales1. Como una dinámica de varias fases de la prueba2,3, nasal PD permite disección funcional del regulador de conductancia transmembrana de la Fibrosis Quística (CFTR) y actividad del canal (ENaC) de sodio epiteliales, ambos localizan en las membranas apicales de las células epiteliales y ejercer roles críticos en la hidratación superficial de la vía aérea. La principal aplicación clínica de la prueba PD nasal es ayudar en el diagnóstico de la FQ, el desorden genético fatal más común en población Caucásica con una incidencia promedio de 1 de cada 2.500 nacidos vivos en países europeos. La prueba larga ha demostrado ser útil en el diagnóstico de formas oligo o mono sintomática atenuada, de la fibrosis quística generalmente se diagnostica más tarde en la vida y de trastornos relacionados con la CF como ausencia bilateral congénita de conductos deferentes, la pancreatitis crónica idiopática, alérgica aspergilosis broncopulmonar y bronquiectasias4. Más recientemente, clinométrica evaluación de la modulación terapéutica de la CFTR básico defecto5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16 ha hecho uso de la PD nasal en los ensayos clínicos de nuevas terapias de CF. En la configuración de preclínica, la prueba ha sido adaptada a ratón17 para permitir la investigación de la bioactividad de nuevo CF blanco terapias18,19,20,21. En ratones, la técnica es delicada, basada en especies relacionadas con las diferencias anatómicas en el tamaño de la región nasal entre roedores y humanos y principalmente en el papel esencial de entradas sensoriales de la región nasofacial en roedores. Requiere operadores entrenados y calificados, maquinaria y equipo dedicado.
CF es un desorden sistémico múltiples de las glándulas exocrinas, en que la enfermedad respiratoria crónica domina el cuadro clínico. La enfermedad es causada por mutaciones en el gene que codificaba el monofosfato de adenosina cíclico (campo)-regulado de canal de cloruro CFTR22. Hasta la fecha, más de 2.000 mutaciones de CFTR han sido identificadas23. El más común mutación24,25, en casi el 90% de los alelos de la CF, corresponde a una supresión del fenilalanina en posición 508 de la cadena polipeptídica de la proteína (F508del-CFTR). La proteína CFTR es un canal puramente óhmica pequeña conductancia del cloruro. También hay evidencia considerable que la CFTR regula otros mecanismos de transporte, en particular, ENaC26,27. Transporte de electrolito defectuoso, incluyendo menor conductancia de cloruro CFTR dependiente y creciente conductancia de sodio ENaC-dependiente, es un sello de epitelios CF. El defecto anterior se refleja en una reducida o suprimida la repolarización en respuesta a una emanación de cloruro que Gradiente electroquímico y la adición de isoprenalina (un agonista β-adrenérgico que aumenta el cAMP intracelular) o forskoline (una adenilato ciclasa agonista, no aprobado para uso clínico). El defecto de este último se refleja en una hiperpolarización basal de la mucosa nasal (un EP más negativo) y una mayor respuesta a amilorida, un medicamento diurético que bloquea ENaC28.
Modelos de ratón de CF se han utilizado con frecuencia en la investigación de CF y han sido invaluables para disección de patología CF. Hoy en día, por lo menos quince modelos han sido descrito29, de los cuales tres son homocigóticos para el clínico más relevante F508del mutación30,31,32. Una de estas tres cepas30, desarrollado en la Universidad Erasmus en Rotterdam, se ha utilizado por casi 20 años en el laboratorio de Université catholique de Louvain (UCL). La Cftrtm1Eur modelo30 ha demostrado para ser muy útil para estudiar la fisiopatología multiorgánica de la enfermedad de CF y comprobar la eficacia de nuevas estrategias terapéuticas18,19,20, 21. Numerosos problemas pueden ocurrir durante o temprano después de (< 24 h) la prueba PD nasal en ratones. En este artículo se describen la profundidad adecuada de la anestesia necesaria para mantener un catéter nasal en situ para la perfusión continua y medidas para evitar la Bronco-aspiración de soluciones de perfusión en la nariz. El cuidado de los animales al final de la prueba también se describe, incluyendo la administración de una combinación de los antídotos de drogas anestésicas, a revertir rápidamente la anestesia con la recuperación completa de los animales. En conjunto, estos procedimientos permiten mediciones fiables en ratones de respiración espontánea, disminución de la mortalidad relacionada con la prueba y repetir la prueba en el mismo animal. Representante de datos obtenidos de la prueba de PD nasal en un CF y un ratón de tipo salvaje se muestran y discuten.
El protocolo de pruebas PD nasal murino se divulga en tres sesiones: evaluación y manejo antes, durante y después de la prueba. En la evaluación pre-test y la gestión, el protocolo de preparación del catéter doble lumen nasal y de las soluciones utilizadas para perfusión continua nasal se describe en detalle. Durante la evaluación y las porciones de la administración de la prueba, el montaje experimental y el manejo del ratón es disecado minuciosamente. Por último, manejo del animal al final de la prueba se describe para mejorar la recuperación completa de animal.
Protocol
Representative Results
Discussion
El objetivo de este trabajo es describir un protocolo adecuado para la medición de PD nasal bajo perfusión continua de soluciones espontáneamente de respiración ratones por un periodo de tiempo necesario para probar la integridad de los transportadores de iones, principalmente CFTR y ENaC. Todos los pasos del protocolo han sido cuidadosamente optimizados para asegurar recuperación completa animal y buena calidad y datos reproducibles. En particulares, importantes pasos son evaluación de anestesia y manejo y adecuad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen la Prof. J. Lebacq edición crítica del manuscrito. CFTRtm1Eur (ratones homocigóticos de F508del-CFTR (FVB/129) fueron desarrollados por el Erasmus MC, Rotterdam, los países bajos, con el apoyo de la Comunidad Económica Europea acción de coordinación europea para la investigación en Fibrosis Quística Unión Europea FP6 LHHM-CT-2005-018932.
Materials
| Portex polyethylene tube | Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL | Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD | to prepare capillary tubes for nasal probe |
| Electrode cream | Parker, Fairfield, NJ, USA | Redux cream | to build electrode bridges |
| Ag/AgCl electrodes | Biomedical, Clinton Township, MI, USA | JNS BNT131-1,0 | measuring and reference electrodes |
| amiloride hydrochloride | Sigma, St Louis, MI, USA | A7410 | to prepare perfusion solutions |
| forskolin | Sigma, St Louis, MI, USA | F6886 | to prepare perfusion solutions |
| Knick Portamess voltmeter | Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany | Portavo 904 pH | to measure potential difference |
| Paraly SW 112 Software | Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany | Paraly SW112 software | to capture potential difference data |
| midazolam | Mylan, Hoeilaart, Belgium | Dormicum 15mg/3ml | to serve as anaesthetic premedication |
| fentanyl | Janssen Cilag, Berchem, Belgium | Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| medetomidine | Orion Pharma, Espoo, Finland | Domitor 1 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| droperidol | Janssen Cilag, Berchem, Belgium | Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| clonidine | Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany | Catapressan 0.15 mg/ml, | to serve as anaesthetic medication |
| refernce IV catheter | Becton Dickinson, Sandy, UT, USA | 24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W | to build electrode bridges |
| forceps | Fine science Tools, Heidelberg, Germany | Dumont #5, Fine science Tools | to place the nasal catheter |
| naloxone | Braun Medical, Brussels, Belgium | Narcan, 0.4 mg/ml | to serve as anaesthetic antagonist |
| atipamezole | Zoetis, Bloomberg, Belgium | Antisedan, 5 mg/ml | to serve as a medetomedine specific antidote |
| Heating pads | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | 18,8×37,5 cm; 15,5×15,5 cm | to avoid hypothermia during and after the test |
| Peristaltic pump P1 | GE Life Sciences, Uppsala, Sweden | 18111091 | to perfuse solutions in the mouse nose |
| cyanoacrylate glue | Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany | super glue 3 | to glue together two capillary tubes for nasal probe |
| NaCl | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0926S-A7 | Pharma-Grade, USP |
| CaCl2.2H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | M7304 | Pharma-Grade, USP |
| MgCl2.6H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551128 | Pharma-Grade, USP |
| K2HPO4 | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551139 | Pharma-Grade, USP |
| Na gluconate | Sigma, St Louis, MI, USA | S2054 | Pharma-Grade, USP |
| Ca gluconate | Sigma, St Louis, MI, USA | C8231 | Pharma-Grade, USP |
| MgSO4.7H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0089M-A7 | Pharma-Grade, USP |
| BD needle | Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA | BD 26G (0.45×10 mm) | intraperitoneal injection |
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