JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

Nasal potentialskillnaden att kvantifiera Trans-epitelial Ion Transport i möss

Published: July 04, 2018
doi:
10.3791/57934
,
1Louvain Center for Toxicology and Applied Pharmacology (LTAP), Institut de Recherche Expérimentale et Clinique (IREC),Université Catholique de Louvain

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att mäta nasal potentialskillnaden i möss. Testet kvantifierar funktionen av transmembrana ion transportörer såsom cystisk fibros transmembrane conductance regulator och kanalen epitelial natrium. Det är värdefullt att utvärdera effekten av nya behandlingar för cystisk fibros.

Abstract

Nasal potentiella skillnaden testet har använts i nästan tre decennier för att bistå vid diagnos av cystisk fibros (CF). Det har visat sig vara till hjälp i fall av försvagade, oligo – eller mono-symtomatisk former för CF oftast diagnostiseras senare i livet, och CF-relaterade störningar såsom medfödd bilateral avsaknad av sädesledaren, idiopatisk kronisk pankreatit, allergisk bronkopulmonell aspergillos och bronkiektasi. I både kliniska och prekliniska inställningar, har testet använts som en biomarkör att kvantifiera Svaren till riktade behandlingsstrategier för jfr anpassa testet till en mus är utmanande och kan medföra en associerad dödlighet. Detta dokument beskriver tillräcklig djup anestesi krävs för att upprätthålla en nasal katetern i situ för kontinuerlig perfusion. En lista över åtgärder för att undvika Bronko-aspiration av lösningar perfusion i näsan. Här beskrivs också djurvård i slutet av testet, inklusive administration av en kombination av motgift av bedövningsmedel droger, leder till snabbt vända anestesi med fullständig återhämtning av djuren. Representativa uppgifter som erhållits från en CF och en vildtyp mus visar att testet diskriminerar mellan CF och icke-CF. Sammantaget tillåter protokollet beskrivs här tillförlitliga mätningar av trans-epitelial klorid och natrium transportörer i spontant andning möss, liksom flera tester på samma djur samtidigt minska funktionell status test-relaterade mortalitet.

Introduction

I nästan tre decennier, har elektriska potentiella skillnaden (PD) mätningar använts att utvärdera transmembrana ion transportörer uttryckt på nässlemhinnan, som företrädare för den distala luftvägar1funktionella status. Som en utgångsämnet dynamisk prov2,3, nasal PD tillåter funktionella dissektion av cystisk fibros Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) och epitelial natrium kanal (ENaC) aktivitet, lokaliserad både till apikala membranen i epitelceller och utövar kritiska roller i airway surface återfuktning. Stora kliniska tillämpningen av nasal PD testet är att bistå vid diagnos av CF, den vanligaste dödlig genetisk sjukdomen hos kaukasiska populationer med en genomsnittlig incidens av 1 av 2500 levande födda i Europeiska länder. Testet har länge visat sig användbart vid diagnos av försvagat, oligo – eller mono-symtomatisk former för CF oftast diagnostiseras senare i livet, och CF-relaterade störningar såsom medfödd bilateral avsaknad av sädesledaren, idiopatisk kronisk pankreatit, allergisk bronkopulmonell aspergillos och bronkiektasi4. Mer nyligen, clinometric utvärdering av den terapeutiska moduleringen av den grundläggande CFTR defekt5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16 har utnyttjat den nasala PD i kliniska prövningar av nya CF terapier. I inställningen för prekliniska har test anpassats till mus17 till möjliggöra undersökning av bioaktiviteten av nya CF mål terapier18,19,20,21. Hos möss är tekniken delikat, baserat på arter-relaterade anatomiska skillnader i storlek i regionen nasal mellan gnagare och människa, och främst på den viktiga rollen som sensoriska input från regionen nasofacial hos gnagare. Det kräver välutbildade och kompetenta operatörer, dedikerad utrustning och förnödenheter.

CF är en multi systemisk sjukdom av exokrina körtlar, som kronisk respiratorisk sjukdom dominerar den kliniska bilden. Sjukdomen orsakas av mutationer i den gen som kodar de cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP)-reglerade CFTR klorid kanal22. Hittills har mer än 2.000 CFTR-mutationer varit identifierade23. Den vanligaste mutationen24,25, Funna i nästan 90% av CF-alleler, motsvarar en borttagning av fenylalanin i position 508 i kedjan polypeptid av proteinet (F508del-CFTR). Det CFTR-proteinet är en renodlat ohmsk små konduktans klorid kanal. Det finns också betydande bevis att CFTR reglerar andra transportmekanismer, i synnerhet ENaC26,27. Defekt elektrolyt transport, inklusive minskad CFTR-beroende klorid konduktans och ökad ENaC-beroende natrium konduktans, är ett kännetecken för CF epitel. Den tidigare defekten återspeglas genom en sänkta eller avskaffade repolarisering svar på både en elektrokemisk gradient gynnar klorid efflux och tillägg av isoprenalin (en β-adrenerg receptoragonist som ökar intracellulära cAMP) eller forskolin (en hypofysadenylatecyclase cyclase agonist, inte godkänd för klinisk användning). Den sistnämnda defekten reflekteras av en basal hyperpolarisering av nässlemhinnan (en mer negativ PD) och en ökad respons till amilorid, ett urindrivande läkemedel som blockerar ENaC28.

CF musmodeller har ofta används i CF forskning och har varit ovärderliga i dissekera CF patologi. Minst femton modeller har nuförtiden, varit beskrivs29, varav tre är homozygota för den mest kliniskt relevanta F508del-mutationen30,31,32. En av dessa tre stammar30, utvecklat vid Erasmusuniversitetet i Rotterdam, har använts i nästan 20 år i Université catholique de Louvain (UCL) laboratorium. De Cftrtm1Eur modell30 har visat sig vara mycket användbart att studera leverfunktiontest patofysiologin av CF sjukdom och att testa effekten av nya terapeutiska strategier18,19,20, 21. Många problem kan uppstå under eller tidigt efter (< 24 h) nasal PD testet hos möss. I detta dokument beskrivs tillräckligt djup anestesi krävs för att hålla en nasal katetern i situ för kontinuerlig perfusion och åtgärder för att undvika Bronko-aspiration av lösningar perfusion i näsan. Djurvård i slutet av testet beskrivs också, inklusive administration av en kombination av motgift av bedövningsmedel droger, leder till snabbt vända anestesi med fullständig återhämtning av djuren. Sammantaget tillåta dessa förfaranden pålitliga mätningar i spontant andning möss, minskade test-relaterad mortalitet och upprepa testet i samma djur. Representativa uppgifter som erhållits från nasal PD testet i en CF och en vildtyp mus visas och diskuteras.

Murina nasal PD testprotokollet rapporteras i tre sessioner: bedömning och hantering före, under och efter provet. I pre-test för bedömning och hantering beskrivs protokollet av beredning av dubbel lumen nasal katetern och lösningar som används för kontinuerlig nasal perfusion i detalj. Under bedömning och hantering av delar av testet, är experimentell installationen och hanteringen av musen minutiöst dissekeras. Slutligen, hantering av djur i slutet av testet beskrivs för att förbättra hela djur återhämtning.

Protocol

De studier och förfaranden som godkändes av den etiska kommittén för djurförsök av UCL (2017/UCL/MD/015) och i samförstånd med Europeiska gemenskapens regler för användning av djur i forskning (CEE n ° 86/609). Utredarna är kvalificerade för de djurförsök som efter direktiv 2010/63/EU av Europaparlamentet och rådet av den 22 September 2010 om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål. 1. testa före bedömning och hantering Förbereda dubbel lumen nasal …

Representative Results

För att illustrera den karakteristiska ion transport avvikelser i CF, utfördes nasal PD mätningar efter det protokoll som beskrivs ovan i en F508del-CF-mus och en vildtyp kontroll av Kandeekane/129 genetiska bakgrunden från Bryssel kolonin CFTRtm1Eur möss30. Denna kliniskt relevant modell, härbärgerat den vanligaste och en av de mest allvarliga F508del-CFTR mutation23,24,<sup cl…

Discussion

Syftet med denna uppsats är att beskriva ett adekvat protokoll för mätning av nasal PD under kontinuerlig perfusion av lösningar i spontant andning möss för en tidsperiod som krävs för att testa integriteten för ion transportörer, främst CFTR och ENaC. Alla steg i protokollet har noga optimerats för att säkerställa full djur återhämtning och god kvalitet och reproducerbara data. I synnerhet, kritiska steg är anestesi bedömning och hantering och adekvat djur position och hand under och efter provet.

…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna vill tacka Prof. J. Lebacq för kritiskt redigering manuskriptet. CFTRtm1Eur (homozygot F508del-CFTR (Kandeekane/129) möss har utvecklats av den Erasmus MC, Rotterdam, Nederländerna, med stöd av Europeiska ekonomiska gemenskapen Europeiska samordning åtgärder för forskning om cystisk fibros EU FP6 LHHM-CT-2005-018932.

Materials

Portex polyethylene tube  Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD to prepare capillary tubes for nasal probe
Electrode cream Parker, Fairfield, NJ, USA Redux cream to build electrode bridges
Ag/AgCl electrodes Biomedical, Clinton Township, MI, USA JNS BNT131-1,0 measuring and reference electrodes
amiloride hydrochloride Sigma, St Louis, MI, USA A7410 to prepare perfusion solutions
forskolin Sigma, St Louis, MI, USA F6886 to prepare perfusion solutions
Knick Portamess voltmeter Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany Portavo 904 pH to measure potential difference
Paraly SW 112 Software  Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany Paraly SW112 software to capture potential difference data
midazolam  Mylan, Hoeilaart, Belgium Dormicum 15mg/3ml to serve as anaesthetic premedication
fentanyl Janssen Cilag, Berchem, Belgium Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml to serve as anaesthetic medication
medetomidine Orion Pharma, Espoo, Finland Domitor 1 mg/ml to serve as anaesthetic medication
droperidol  Janssen  Cilag, Berchem, Belgium Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml to serve as anaesthetic medication
clonidine  Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany Catapressan 0.15 mg/ml, to serve as anaesthetic medication
refernce IV catheter Becton Dickinson, Sandy, UT, USA 24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W to build electrode bridges
forceps  Fine science Tools, Heidelberg, Germany Dumont #5, Fine science Tools to place the nasal catheter
naloxone  Braun Medical, Brussels, Belgium Narcan, 0.4 mg/ml to serve as anaesthetic antagonist
atipamezole  Zoetis, Bloomberg, Belgium Antisedan, 5 mg/ml to serve as a medetomedine specific antidote 
Heating pads  Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA 18,8×37,5 cm; 15,5×15,5 cm to avoid hypothermia during and after the test
Peristaltic pump P1 GE Life Sciences, Uppsala, Sweden 18111091 to perfuse solutions in the mouse nose
cyanoacrylate glue Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany  super glue 3 to glue together two capillary tubes  for nasal probe
NaCl Sigma, St Louis, MI, USA RES0926S-A7 Pharma-Grade, USP
CaCl2.2H2O Sigma, St Louis, MI, USA M7304 Pharma-Grade, USP
MgCl2.6H2O Sigma, St Louis, MI, USA 1551128 Pharma-Grade, USP
K2HPO4 Sigma, St Louis, MI, USA 1551139 Pharma-Grade, USP
Na gluconate Sigma, St Louis, MI, USA S2054 Pharma-Grade, USP
Ca gluconate Sigma, St Louis, MI, USA C8231 Pharma-Grade, USP
MgSO4.7H2O Sigma, St Louis, MI, USA RES0089M-A7 Pharma-Grade, USP
BD needle  Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA BD 26G (0.45×10 mm) intraperitoneal injection
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knowles, M., Gatzy, J., Boucher, R. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in cystic fibrosis. New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1495 (1981).
  2. Middleton, P. G., Geddes, D. M., Alton, E. F. W. Protocols for in vivo measurement of the ion transport defects in cystic fibrosis nasal epithelium. European Respiratory Journal. 7 (11), 2050-2056 (1994).
  3. Knowles, M. R., Paradiso, A. M., Boucher, R. C. In vivo nasal potential difference: techniques and protocols for assessing efficacy of gene transfer in cystic fibrosis. Human Gene Therapy. 6 (4), 445-455 (1995).
  4. Paranjape, S. M., Zeitlin, P. L. Atypical cystic fibrosis and CFTR-related disorders. Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 35 (3), 116-123 (2008).
  5. Wilschanski, M., et al. A pilot study of the effect of gentamicin on nasal potential difference measurements in CF patients carrying stop mutations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (3), 860-865 (2000).
  6. Clancy, J. P., et al. Evidence that systemic gentamicin suppresses premature stop mutations in patients with CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163 (7), 1683-1692 (2001).
  7. Wilschanski, M., et al. Gentamicin-induced correction of CFTR function in patients with CF and CFTR stop mutations. New England Journal of Medicine. 349 (15), 1433-1441 (2003).
  8. Sermet-Gaudelus, I., et al. In vitro prediction of stop-codon suppression by intravenous gentamicin in patients with CF: a pilot study. BMC Medicine. 5, 5 (2007).
  9. Clancy, J. P., et al. No detectable improvements in CF transmembrane conductance regulator by nasal aminoglycosides in patients with CF with stop mutations. American Journal of Respiratory and Cell Molecular Biology. 37 (1), 57-66 (2007).
  10. Kerem, E., et al. Effectiveness of PTC124 treatment of CF caused by nonsensemutations: a prospective phase II trial. Lancet. 372 (9640), 719-727 (2008).
  11. Sermet-Gaudelus, I., et al. Ataluren (PTC124) induces CF transmembrane conductance regulator protein expression and activity in children with nonsense mutation CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (10), 1262-1272 (2010).
  12. Wilschanski, M., et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 38 (1), 59-69 (2011).
  13. Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with CF and the G551D-CFTR mutation. New England Journal of Medicine. 363 (21), 1991-2003 (2010).
  14. Clancy, J. P., et al. Results of a phase IIa study of VX-809, an investigational CFTR corrector compound, in subjects with cystic fibrosis homozygous for the F508del-CFTR mutation. Thorax. 67 (1), 12-18 (2012).
  15. Leonard, A., Lebecque, P., Dingemanse, J., Leal, T. A randomized placebo-controlled trial of miglustat in cystic fibrosis based on nasal potential difference. Journal of Cystic Fibrosis. 11 (3), 231-236 (2012).
  16. De Boeck, K., et al. CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate end-point. European Respiratory Journal. 41, 203-216 (2013).
  17. Leal, T., et al. Successful protocol of anaesthesia for measuring transepithelial nasal potential difference in spontaneously breathing mice. Laboratory Animals. 40 (1), 43-52 (2006).
  18. Lubamba, B., et al. Preclinical evidence that sildenafil and vardenafil activate chloride transport in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (5), 506-515 (2008).
  19. Lubamba, B., et al. Airway delivery of low-dose miglustat normalizes nasal potential difference in F508del cystic fibrosis mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (11), 1022-1028 (2009).
  20. Lubamba, B., et al. Inhaled PDE5 inhibitors restore chloride transport in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 37 (1), 72-78 (2011).
  21. Vidovic, D., et al. rAAV-CFTRΔR Rescues the Cystic Fibrosis Phenotype in Human Intestinal Organoids and Cystic Fibrosis Mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 288-298 (2016).
  22. Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
  23. Lubamba, B., Dhooghe, B., Noel, S., Leal, T. Cystic fibrosis: insight into CFTR pathophysiology and pharmacotherapy. Clinical Biochemistry. 45 (15), 1132-1144 (2012).
  24. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
  25. Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4925), 1066-1073 (1989).
  26. Stutts, M. J., Rossier, B. C., Boucher, R. C. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inverts protein kinase A-mediated regulation of epithelial sodium channel single channel kinetics. Journal of Biological Chemistry. 272 (22), 14037-14040 (1997).
  27. Ismailov, I. I., et al. Regulation of epithelial sodium channels by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biological Chemistry. 271 (9), 4725-4732 (1996).
  28. Althaus, M. ENaC inhibitors and airway re-hydration in cystic fibrosis: state of the art. Current Molecular Pharmacology. 6 (1), 3-12 (2013).
  29. Wilke, M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, 152-171 (2011).
  30. Van Doorninck, J. H., et al. A mouse model for the cystic fibrosis delta F508 mutation. The EMBO Journal. 14 (18), 4403-4411 (1995).
  31. Colledge, W. H., et al. Generation and characterization of a delta F508 cystic fibrosis mouse model. Nature Genetics. 10 (4), 445-452 (1995).
  32. Zeiher, B. G., et al. A mouse model for the delta F508 allele of cystic fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 96 (4), 2051-2064 (1995).
  33. Ghosal, S., Taylor, C. J., McGray, J. Modification of the nasal membrane potential difference with inhaled amiloride and loperamide in the cystic fibrosis (CF) mouse. Thorax. 51 (12), 1229-1232 (1996).
  34. Ghosal, S., Taylor, C. J., Colledge, W. H., Ratcliff, R., Evans, M. J. Sodium channel blockers and uridine triphosphate: effects on nasal potential difference in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 15 (1), 146-150 (2000).
  35. Leonard, A., et al. Comparative Variability of Nasal Potential Difference Measurements in Human and Mice. Open Journal of Respiratory Disease. 2, 43-56 (2012).
  36. Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch’s 3Rs then and now: the need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
  37. Pritchett-Corning, K. R., et al. AALAS/FELASA Working Group on Health Monitoring of rodents for animal transfer. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 633-640 (2014).
  38. Salinas, D. B., et al. CFTR involvement in nasal potential differences in mice and pigs studied using a thiazolidinone CFTR inhibitor. American Journal of Physiology. Lung Cell Molecular Physiology. 287 (5), 936-943 (2004).
  39. Fisher, J. T., et al. Comparative processing and function of human and ferret cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Journal of Biological Chemistry. 287 (26), 21673-21685 (2012).
  40. Kaza, N., et al. Use of ferrets for electrophysiologic monitoring of ion transport. PLoS One. 12 (10), 0186984 (2017).
  41. Leal, T., Beka, M., Panin, N., Mall, M. A., Noel, S. Nasal potential difference in βENaC-overexpressing mouse reveals pH-sensitive channel hyperactivity and shift of subunits stoichiometry. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (S1), 72 (2017).
  42. Mall, M., Grubb, B. R., Harkema, J. R., O’Neal, W. K., Boucher, R. C. Increased airway epithelial Na+ absorption produces cystic fibrosis-like lung disease in mice. Nature Medicine. 10 (5), 487-493 (2004).
  43. Shah, V. S., et al. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice. Science. 351 (6272), 503-507 (2016).

Tags

Nasal Potential DifferenceCystic FibrosisTransgenic MiceIon TransportDouble Lumen Nasal CatheterElectrolyte CreamVoltmeterPeristaltic PumpData Capture Software
check_url/kr/57934?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Beka, M., Leal, T. Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice. J. Vis. Exp. (137), e57934, doi:10.3791/57934 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image