JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

Trans-epitel iyon taşıma farelerde ölçmek için burun potansiyel fark

Published: July 04, 2018
doi:
10.3791/57934
,
1Louvain Center for Toxicology and Applied Pharmacology (LTAP), Institut de Recherche Expérimentale et Clinique (IREC),Université Catholique de Louvain

Summary

Burada, farelerde burun potansiyel farkı ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Test transmembran iyon taşıyıcılar Kistik Fibrozis Transmembran gürültülerinden regülatör ve epitel sodyum kanalı gibi işlev quantifies. Kistik fibrozis için roman tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için değerlidir.

Abstract

Burun potansiyel farkı test neredeyse üç yıldır kistik fibrozis (CF) tanısında yardımcı olmak için kullanılmıştır. Durumlarında yardımcı olmak, zayıflatılmış oligo veya mono semptomatik formlar genellikle daha sonra hayatında tanısı CF ve vas deferens, idiyopatik kronik pankreatit, Alerjik ikili konjenital yokluğu gibi CF ile ilgili hastalıkların kanıtlamıştır bronkopulmoner aspergilloz ve bronşiektazi. CF. uyarlayarak test etmek için bir fare için hedeflenmiş tedavi stratejileri yanıtlarını ölçmek için bir biyomarker meydan okuyor ve ilişkili bir ölüm gerektirecektir preklinik ve klinik ayarları, testi kullanılmıştır. Bu kağıt için sürekli perfüzyon burun kateter in situ korumak için gerekli anestezi yeterli derinliği açıklar. Solunum-aspirasyon burnuna periosteum çözümleri önlemek için ölçülerin listeler. Ayrıca hayvan bakımı panzehir hızla anestezi hayvanların tam kurtarma ile geri için önde gelen anestezik ilaçların bir arada, yönetimi de dahil olmak üzere test sonunda açıklar. Temsilcisi veri bir CF ve test CF ve sigara-CF arasında ayrımcılık bir vahşi tipi fare Haritayı aldı. Özet olarak, burada açıklanan protokol test ile ilgili güvenilir ölçümler spontan solunum farelerde trans-epitel klorür ve sodyum taşıyıcılar gibi azaltırken aynı hayvan birden çok test fonksiyonel durumu sağlar ölüm.

Introduction

Neredeyse üç yıl için elektrik potansiyel farkı (PD) ölçümleri transmembran iyon taşıyıcılar, nazal mukoza, distal airways1temsilcisi olarak ifade edilen fonksiyonel durumunu değerlendirmek için kullanılmaktadır. Bir multistep dinamik test olarak2,3, nazal PD Kistik Fibrozis Transmembran gürültülerinden regülatörü (CFTR) ve epitel sodyum kanal (ENaC) etkinlik, fonksiyonel diseksiyon sağlar her ikisi de apikal zarı lokalize epitel hücreleri ve hava yolu yüzey hidrasyon önemli rollerde uygulamakla. Büyük klinik uygulama burun PD testinin CF, 1 dışarı-in 2500 canlı Doğum Avrupa ülkelerinde ortalama bir insidans ile beyaz nüfus en yaygın ölümcül genetik bozukluk tanısında yardımcı olmaktır. Test uzun zayıflatılmış, oligo veya mono semptomatik formlar genellikle daha sonra hayatında tanısı CF ve vas deferens, idiyopatik kronik pankreatit, Alerjik ikili konjenital yokluğu gibi CF ile ilgili hastalıkların tanısında yararlı kanıtlamıştır bronkopulmoner aspergilloz ve bronşiektazi4. Daha yakın zamanlarda,5,6,7,8,9,10,11 defect temel CFTR tedavi modülasyon clinometric değerlendirilmesi ,12,13,14,15,16 burun PD klinik çalışmalarda yeni CF tedavilerin kullanımı yaptı. Preklinik ayarında test yeni CF hedef terapiler18,19,20,21bioactivity incelenmesi izin vermek için fare17 ‘ ye uyarlanmıştır. Farelerde, kemirgenler ve insan arasındaki burun bölgenin boyutunu türler ile ilgili anatomik farklılıkları ve ağırlıklı olarak Rodents nasofacial bölgesinden duyusal girdilerin önemli rol dayalı hassas, bir tekniktir. Eğitimli ve vasıflı operatörler, özel ekipman ve malzemeleri gerektirir.

CF ekzokrin bezleri, çok sistemik bir hastalığı olduğunu hangi kronik solunum yolu hastalığı klinik resim hakim. Hastalığı siklik adenozin monofosfattır (kampı) kodlama gen mutasyonlar neden olur-CFTR klorür kanal22düzenlenir. Bugüne kadar 2.000’den fazla CFTR mutasyonları tespit23olmuştur. CF gen, neredeyse % 90 bulundu en yaygın mutasyon24,25, Fenilalanin polipeptid zinciri protein (F508del-CFTR) 508 pozisyonda silinmesiyle karşılık gelir. CFTR proteini bir tamamen içinden küçük gürültülerinden klorür kanalıdır. CFTR diğer taşıma mekanizmaları, özellikle de ENaC26,27düzenleyen önemli kanıtlar vardır. Arızalı elektrolit taşıma azaltılmış CFTR bağımlı klorür gürültülerinden ve artan ENaC bağımlı sodyum gürültülerinden, dahil olmak üzere, CF epiteli özelliğidir. Eski kusur küçültülmüş veya kaldırılmış repolarization bir elektrokimyasal gradyan favour klorür sızma ve isoprenaline (hücre içi kampı artıran bir β-adrenergic agonist) veya forskolin (bir adenilat eklenmesi karşısında yansıtır klinik kullanım için onaylanmamış cyclase agonist,). İkincisi kusur bazal hyperpolarization nazal mukoza (daha olumsuz PD) ve amiloride, ENaC28blok bir idrar söktürücü ilaç için artan bir tepki yansıtır.

CF fare modelleri sık CF araştırmalarında kullanılan ve CF patoloji dissekan çok değerli olmuştur. Günümüzde, en az on beş modelleri açıklanan üç olan en klinik F508del mutasyon30,31,32için homozigoz29, olmuştur. Bir Rotterdam, Erasmus Üniversitesi’nde geliştirilen bu üç suş30, yaklaşık 20 yıldır Université catholique de Louvain (UCL) laboratuvar olarak kullanılmıştır. Cftrtm1Eur modeli30 CF hastalığı multiorgan Patofizyoloji çalışmaya ve yeni tedavi stratejileri18,19,20etkinliğini test etmek için çok yararlı olduğunu kanıtlamıştır, 21. Çok sayıda sorunları sırasında veya erken sonra ortaya çıkabilir (< 24 h) farelerde burun PD testi. Bu yazıda, anestezi solunum-aspirasyon burnuna periosteum çözümleri önlemek için sürekli perfüzyon ve önlemleri burun kateter situ içinde tutmak için gereken yeterli derinliği açıklanmıştır. Test sonunda hayvan bakımı da, panzehir hızla anestezi hayvanların tam kurtarma ile geri için önde gelen anestezik ilaçların bir arada, yönetimi de dahil olmak üzere tanımlanır. Özet olarak, bu yordamları güvenilir ölçümler spontan solunum fareler, azaltılmış testi ile ilgili mortalite ve aynı hayvan içinde belgili tanımlık sınav yinelenen sağlar. Temsilcisi veri burun PD testinden bir CF ve vahşi-tipi fare elde gösterilen ve tartışıldı.

Fare burun PD test protokolü üç oturumlarda bildirilmektedir: değerlendirmesi ve yönetimi öncesinde, sırasında ve sonra testi. Ön-test değerlendirmesi ve yönetimi hazırlık çift lümen burun kateter ve çözümleri sürekli burun perfüzyon için kullanılan protokolü ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Değerlendirme ve test yönetimi bölümleri sırasında deneysel kurulum ve fare kullanımı özenle kesmiştim. Son olarak, hayvan test sonunda yönetiminin tam hayvan kurtarma geliştirmek için tanımlanır.

Protocol

Çalışmalar ve yordamlar hayvan araştırma (2017/UCL/MD/015) UCL’nin ve hayvan araştırma (CEE n ° 86/609) kullanımda Avrupa Birliği Yönetmeliği ile anlaşma için Etik Komitesi tarafından kabul edildi. Araştırmacılar bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunması yönergesi 2010/63/AB sayılı Avrupa Parlamentosu ve Konsey, 22 Eylül 2010 aşağıdaki hayvan deneme için nitelikli. 1. değerlendirmesi ve yönetimi ön test Çift lümen burun kateter hazırla.<b…

Representative Results

CF karakteristik iyon taşıma anormallikleri göstermek için burun PD ölçümleri bir F508del-CF fare ve Brüksel kolonisi FVB/129 genetik kökenli bir vahşi tipi kontrol yukarıda açıklanan protokol sonrası gerçekleştirilen CFTRtm1Eur fareler30. En yaygın ve en ağır F508del-CFTR mutasyon23,24,25, birini barındıran bu klinik modeli en iyisi şu and…

Discussion

Bu kağıt amacı çözümleri farelerde kendiliğinden nefes iyon taşıyıcılar, esas olarak CFTR ve ENaC bütünlüğünü test etmek için gereken süreyi için sürekli perfüzyon altında burun PD ölçmek için yeterli bir iletişim kuralı tarif etmektir. İletişim kuralının tüm adımları dikkatlice tam hayvan kurtarma ve kaliteli ve tekrarlanabilir veri sağlamak için optimize edilmiştir. Özellikle, kritik adımlarda anestezi değerlendirmesi ve yönetimi ve yeterli hayvan pozisyon ve bakım sırasında…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Prof. J. Lebacq eleştirel yazının düzenleme için teşekkür ederiz. CFTRtm1Eur (homozigoz F508del-CFTR (FVB/129) fareler tarafından geliştirilen Erasmus MC, Rotterdam, Hollanda, Avrupa Ekonomik Topluluğu Avrupa koordinasyon eylem kistik fibrozis Avrupa Birliği FP6 araştırma desteği ile LHHM-CT-2005-018932.

Materials

Portex polyethylene tube  Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD to prepare capillary tubes for nasal probe
Electrode cream Parker, Fairfield, NJ, USA Redux cream to build electrode bridges
Ag/AgCl electrodes Biomedical, Clinton Township, MI, USA JNS BNT131-1,0 measuring and reference electrodes
amiloride hydrochloride Sigma, St Louis, MI, USA A7410 to prepare perfusion solutions
forskolin Sigma, St Louis, MI, USA F6886 to prepare perfusion solutions
Knick Portamess voltmeter Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany Portavo 904 pH to measure potential difference
Paraly SW 112 Software  Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany Paraly SW112 software to capture potential difference data
midazolam  Mylan, Hoeilaart, Belgium Dormicum 15mg/3ml to serve as anaesthetic premedication
fentanyl Janssen Cilag, Berchem, Belgium Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml to serve as anaesthetic medication
medetomidine Orion Pharma, Espoo, Finland Domitor 1 mg/ml to serve as anaesthetic medication
droperidol  Janssen  Cilag, Berchem, Belgium Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml to serve as anaesthetic medication
clonidine  Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany Catapressan 0.15 mg/ml, to serve as anaesthetic medication
refernce IV catheter Becton Dickinson, Sandy, UT, USA 24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W to build electrode bridges
forceps  Fine science Tools, Heidelberg, Germany Dumont #5, Fine science Tools to place the nasal catheter
naloxone  Braun Medical, Brussels, Belgium Narcan, 0.4 mg/ml to serve as anaesthetic antagonist
atipamezole  Zoetis, Bloomberg, Belgium Antisedan, 5 mg/ml to serve as a medetomedine specific antidote 
Heating pads  Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA 18,8×37,5 cm; 15,5×15,5 cm to avoid hypothermia during and after the test
Peristaltic pump P1 GE Life Sciences, Uppsala, Sweden 18111091 to perfuse solutions in the mouse nose
cyanoacrylate glue Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany  super glue 3 to glue together two capillary tubes  for nasal probe
NaCl Sigma, St Louis, MI, USA RES0926S-A7 Pharma-Grade, USP
CaCl2.2H2O Sigma, St Louis, MI, USA M7304 Pharma-Grade, USP
MgCl2.6H2O Sigma, St Louis, MI, USA 1551128 Pharma-Grade, USP
K2HPO4 Sigma, St Louis, MI, USA 1551139 Pharma-Grade, USP
Na gluconate Sigma, St Louis, MI, USA S2054 Pharma-Grade, USP
Ca gluconate Sigma, St Louis, MI, USA C8231 Pharma-Grade, USP
MgSO4.7H2O Sigma, St Louis, MI, USA RES0089M-A7 Pharma-Grade, USP
BD needle  Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA BD 26G (0.45×10 mm) intraperitoneal injection
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knowles, M., Gatzy, J., Boucher, R. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in cystic fibrosis. New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1495 (1981).
  2. Middleton, P. G., Geddes, D. M., Alton, E. F. W. Protocols for in vivo measurement of the ion transport defects in cystic fibrosis nasal epithelium. European Respiratory Journal. 7 (11), 2050-2056 (1994).
  3. Knowles, M. R., Paradiso, A. M., Boucher, R. C. In vivo nasal potential difference: techniques and protocols for assessing efficacy of gene transfer in cystic fibrosis. Human Gene Therapy. 6 (4), 445-455 (1995).
  4. Paranjape, S. M., Zeitlin, P. L. Atypical cystic fibrosis and CFTR-related disorders. Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 35 (3), 116-123 (2008).
  5. Wilschanski, M., et al. A pilot study of the effect of gentamicin on nasal potential difference measurements in CF patients carrying stop mutations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (3), 860-865 (2000).
  6. Clancy, J. P., et al. Evidence that systemic gentamicin suppresses premature stop mutations in patients with CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163 (7), 1683-1692 (2001).
  7. Wilschanski, M., et al. Gentamicin-induced correction of CFTR function in patients with CF and CFTR stop mutations. New England Journal of Medicine. 349 (15), 1433-1441 (2003).
  8. Sermet-Gaudelus, I., et al. In vitro prediction of stop-codon suppression by intravenous gentamicin in patients with CF: a pilot study. BMC Medicine. 5, 5 (2007).
  9. Clancy, J. P., et al. No detectable improvements in CF transmembrane conductance regulator by nasal aminoglycosides in patients with CF with stop mutations. American Journal of Respiratory and Cell Molecular Biology. 37 (1), 57-66 (2007).
  10. Kerem, E., et al. Effectiveness of PTC124 treatment of CF caused by nonsensemutations: a prospective phase II trial. Lancet. 372 (9640), 719-727 (2008).
  11. Sermet-Gaudelus, I., et al. Ataluren (PTC124) induces CF transmembrane conductance regulator protein expression and activity in children with nonsense mutation CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (10), 1262-1272 (2010).
  12. Wilschanski, M., et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 38 (1), 59-69 (2011).
  13. Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with CF and the G551D-CFTR mutation. New England Journal of Medicine. 363 (21), 1991-2003 (2010).
  14. Clancy, J. P., et al. Results of a phase IIa study of VX-809, an investigational CFTR corrector compound, in subjects with cystic fibrosis homozygous for the F508del-CFTR mutation. Thorax. 67 (1), 12-18 (2012).
  15. Leonard, A., Lebecque, P., Dingemanse, J., Leal, T. A randomized placebo-controlled trial of miglustat in cystic fibrosis based on nasal potential difference. Journal of Cystic Fibrosis. 11 (3), 231-236 (2012).
  16. De Boeck, K., et al. CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate end-point. European Respiratory Journal. 41, 203-216 (2013).
  17. Leal, T., et al. Successful protocol of anaesthesia for measuring transepithelial nasal potential difference in spontaneously breathing mice. Laboratory Animals. 40 (1), 43-52 (2006).
  18. Lubamba, B., et al. Preclinical evidence that sildenafil and vardenafil activate chloride transport in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (5), 506-515 (2008).
  19. Lubamba, B., et al. Airway delivery of low-dose miglustat normalizes nasal potential difference in F508del cystic fibrosis mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (11), 1022-1028 (2009).
  20. Lubamba, B., et al. Inhaled PDE5 inhibitors restore chloride transport in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 37 (1), 72-78 (2011).
  21. Vidovic, D., et al. rAAV-CFTRΔR Rescues the Cystic Fibrosis Phenotype in Human Intestinal Organoids and Cystic Fibrosis Mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 288-298 (2016).
  22. Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
  23. Lubamba, B., Dhooghe, B., Noel, S., Leal, T. Cystic fibrosis: insight into CFTR pathophysiology and pharmacotherapy. Clinical Biochemistry. 45 (15), 1132-1144 (2012).
  24. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
  25. Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4925), 1066-1073 (1989).
  26. Stutts, M. J., Rossier, B. C., Boucher, R. C. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inverts protein kinase A-mediated regulation of epithelial sodium channel single channel kinetics. Journal of Biological Chemistry. 272 (22), 14037-14040 (1997).
  27. Ismailov, I. I., et al. Regulation of epithelial sodium channels by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biological Chemistry. 271 (9), 4725-4732 (1996).
  28. Althaus, M. ENaC inhibitors and airway re-hydration in cystic fibrosis: state of the art. Current Molecular Pharmacology. 6 (1), 3-12 (2013).
  29. Wilke, M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, 152-171 (2011).
  30. Van Doorninck, J. H., et al. A mouse model for the cystic fibrosis delta F508 mutation. The EMBO Journal. 14 (18), 4403-4411 (1995).
  31. Colledge, W. H., et al. Generation and characterization of a delta F508 cystic fibrosis mouse model. Nature Genetics. 10 (4), 445-452 (1995).
  32. Zeiher, B. G., et al. A mouse model for the delta F508 allele of cystic fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 96 (4), 2051-2064 (1995).
  33. Ghosal, S., Taylor, C. J., McGray, J. Modification of the nasal membrane potential difference with inhaled amiloride and loperamide in the cystic fibrosis (CF) mouse. Thorax. 51 (12), 1229-1232 (1996).
  34. Ghosal, S., Taylor, C. J., Colledge, W. H., Ratcliff, R., Evans, M. J. Sodium channel blockers and uridine triphosphate: effects on nasal potential difference in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 15 (1), 146-150 (2000).
  35. Leonard, A., et al. Comparative Variability of Nasal Potential Difference Measurements in Human and Mice. Open Journal of Respiratory Disease. 2, 43-56 (2012).
  36. Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch’s 3Rs then and now: the need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
  37. Pritchett-Corning, K. R., et al. AALAS/FELASA Working Group on Health Monitoring of rodents for animal transfer. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 633-640 (2014).
  38. Salinas, D. B., et al. CFTR involvement in nasal potential differences in mice and pigs studied using a thiazolidinone CFTR inhibitor. American Journal of Physiology. Lung Cell Molecular Physiology. 287 (5), 936-943 (2004).
  39. Fisher, J. T., et al. Comparative processing and function of human and ferret cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Journal of Biological Chemistry. 287 (26), 21673-21685 (2012).
  40. Kaza, N., et al. Use of ferrets for electrophysiologic monitoring of ion transport. PLoS One. 12 (10), 0186984 (2017).
  41. Leal, T., Beka, M., Panin, N., Mall, M. A., Noel, S. Nasal potential difference in βENaC-overexpressing mouse reveals pH-sensitive channel hyperactivity and shift of subunits stoichiometry. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (S1), 72 (2017).
  42. Mall, M., Grubb, B. R., Harkema, J. R., O’Neal, W. K., Boucher, R. C. Increased airway epithelial Na+ absorption produces cystic fibrosis-like lung disease in mice. Nature Medicine. 10 (5), 487-493 (2004).
  43. Shah, V. S., et al. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice. Science. 351 (6272), 503-507 (2016).

Tags

Nasal Potential DifferenceCystic FibrosisTransgenic MiceIon TransportDouble Lumen Nasal CatheterElectrolyte CreamVoltmeterPeristaltic PumpData Capture Software
check_url/kr/57934?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Beka, M., Leal, T. Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice. J. Vis. Exp. (137), e57934, doi:10.3791/57934 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image