Imaging FITC-dextran som Reporter för reglerade exocytos

Summary

Här detalj vi en metod för levande cell avbildning av reglerade exocytos. Denna metod använder FITC-dextran, som ackumuleras i lysosomen-relaterade organeller, som reporter. Den här enkla metoden kan också skilja mellan olika lägen av reglerade exocytos i celler som är svåra att manipulera genetiskt.

Abstract

Reglerade exocytos är en process genom vilken last, som lagras i sekretoriska granuler (SGs), släpps som svar på en sekretoriska utlösare. Reglerade exocytos är grundläggande för kommunikationen och är en viktig mekanism för utsöndringen av neurotransmittorer, hormoner, inflammatoriska mediatorer och andra föreningar, av en mängd olika celler. Minst tre olika mekanismer är kända för reglerade exocytos: full exocytos, där en enda SG fullt säkringar med plasmamembranet, kiss-och-kör exocytos, där en enda SG normalnivå säkringar med plasmamembranet, och sammansatta exocytos, där flera SGs säkring med varandra, före eller efter SG fusion med plasmamembranet. Typ av reglerade exocytos som genomförs av en cell är ofta styrs av vilken typ av sekretoriska trigger. Dock i många celler, kan en enda sekretoriska utlösare aktivera flera lägen av reglerade exocytos samtidigt. Trots deras överflöd och vikten över celltyper och arter är de mekanismer som bestämmer de olika transportsätten sekretion till stor del olösta. En av de viktigaste utmaningarna i att undersöka de olika transportsätten reglerade exocytos, är svårighet att skilja mellan dem samt att utforska dem separat. Här beskriver vi användningen av fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC)-dextran som exocytos reporter och levande cell imaging, för att skilja mellan de olika vägarna i reglerade exocytos, med fokus på sammansatta exocytos, baserat på robustheten och varaktighet av exocytic händelser.

Introduction

Reglerade exocytos är den primära mekanismen genom vilken lätt gjort Last släpps från en sekretoriska celler som svar på en specifik utlösare. Lasten är pre bildats och binds in sekretoriska vesikler, där det lagras tills en utlösare vidarebefordrar signalen för frisläppandet av SGs’ innehåll. Olika typer av signaler kan resultera i olika lägen av reglerade exocytos, eller olika lägen av reglerade exocytos kan förekomma samtidigt. Tre huvudsakliga typer av reglerade exocytos är kända: full exocytos, som innebär full fusion av en inre sekretoriska granule med plasmamembranet; Kiss-och-kör exocytos, som involverar övergående fusion av det sekretoriska granulat med plasmamembranet följt av återvinning; och sammansatta exocytos, som kännetecknas av homotypic fusion av flera SGs före (dvs, multigranular exocytos) eller sekventiella (dvs, sekventiell exocytos) till fusion med plasmamembranet¹. Sammansatta exocytos anses mest omfattande funktionsläget av Last release², eftersom det ger snabb utsöndringen av last, till exempel som från SGs som ligger distalt från plasmamembranet. Sammansatta exocytos har dokumenterats i både exokrina och endokrina celler^{3,4,5,6,7,8,9}, samt i immunceller. I immunceller, såsom eosinofiler^10,11,12 och neutrofiler¹³, tillåter sammansatta exocytos snabb och robust frisläppandet av medlare som krävs för att döda invaderande patogener såsom bakterier eller parasiter. Mastceller (MCs) distribuera sammansatta exocytos för effektiv frisläppandet av förlagrade inflammatoriska mediatorer under medfödda immunsvar, anafylaxi och andra allergiska reaktioner^{14,15,16 , 17}. eftersom de olika transportsätten exocytos kan förekomma samtidigt^18,19, det har blivit en utmaning att särskilja dem i realtid eller för att identifiera deras respektive fusion maskinerier, därmed klarlägga deras bakomliggande mekanismer.

Här presenterar vi en metod, som bygger på levande cell avbildning av cell laddad FITC-dextran, som tillåter realtid spårning av exocytic händelser och skilja mellan sina olika lägen. Vår metod tillåter särskilt exklusiva övervakning av sammansatta exocytos.

FITC-dextran är ett konjugat av pH-känsliga fluorophore FITC med den glukan polysackarid dextran. Fluorescently märkta dextrans har visat sig in i cellen av micropinocytosis^20,21 och macropinocytosis^22,23. Som endocytic fack mogna i lysosomer, har det visats att FITC-dextran ackumuleras i lysosomen med någon uppenbar försämring. Men eftersom FITC är ett högt pH-känsliga fluorophore²⁴, och Lysosomen lumen är surt, släcker FITC-dextran fluorescens när du når den Lysosomen²⁴. Således att etablera dextrans som Lysosomen riktade Last, tillsammans med FITC pH känslighet, har lagt grunden för användning av FITC-dextran i studier av Lysosomen exocytos^{25,26,27 , 28 , 29}.

I flera celltyper, inklusive MCs, neutrofiler, eosinofiler, cytotoxiska T-celler, melanosomer och andra, SGs lysosomala visningsfunktioner och klassificeras Lysosomen-relaterade organeller (LROs) eller sekretoriska lysosomer^30,31 . Eftersom LROs har en sura luminala pH, kan FITC-dextran användas för att visualisera deras exocytos, till följd av högre pH är associerad med exteriorisering av LROs. FITC-dextran har faktiskt använts för att övervaka exocytos i MCs^18,32,33. Den här metoden läggs till cellkulturen FITC-dextran, tas upp av cellerna av pinocytosis och sorterade i SGs. Som det är i lysosomer, är FITC fluorescens kylda i SGs när de är inom cellen. Dock vid SG fusion med plasmamembranet och åtföljande exponering för den yttre miljön återfår den FITC-dextran dess fluorescens som SG pH stiger, möjliggör enkel spårning av exocytic händelser av levande cell mikroskopi. Här, vi har anpassat denna metod om du vill aktivera unika spårning av sammansatta exocytos.

Två andra metoder har använts tidigare att spåra sammansatta exocytos. Elektronmikroskopi var den första metoden att karakterisera exocytic strukturer som föreslog förekomsten av olika lägen av exocytos. Särskilt gav yttrande av ”sekretoriska tunnlar” i bukspottskörteln acinar celler³⁴ och MCs^35,36,37 upphov till hypotesen om sammansatta exocytos. Men, medan den höga upplösningen av elektronmikroskopi har makt att avslöja smält blåsor, det kan inte spåra dynamiken i deras fusion och därmed kan inte definiera om de motsvarar SG fusion under förening exocytos eller fusion återerövrade granulat efter deras endocytos. Detta hinder övervinns i andra metoder som kan mäta exocytos i levande celler, såsom patch clamp mått plasmamembranet kapacitans^11,13,38,39 eller amperometry ⁴⁰ av media. Dock patch fastspänning kräver en speciell set-up och kanske inte lämpliga för alla celltyper. Amperometry mätningar kan spåra exocytos endast om lasten är släppt i mycket nära anslutning till elektroden. Därför, med hjälp av levande cell imaging erbjuder en fördel över dessa metoder, som inte bara gör det möjligt för realtid spårning av exocytos, men det ger också snabb och enkel insamling av data från hela cellen.

Spårning av FITC-dextran av levande cell mikroskopi erbjuder också några fördelar till andra levande cell imaging-baserade metoder. En allmänt använd metod är till exempel totalreflexion fluorescensmikroskopi (TIRFM) i cellerna laddad med en fluorescerande SG sond eller uttrycka en fluorescerande protein-taggade SG last eller membran protein^{26,41, 42 , 43}. denna metod styrka ligger i dess förmåga att övervaka uteslutande händelser som inträffar nära plasmamembranet (hädanefter kallas fotavtryck), därav exocytic händelser. Detta är dock också nackdelen med denna metod, eftersom endast den cell-fraktionen som angränsar till täckglas och nära Mikroskop linsen kan vara avbildade⁴⁴. Huruvida sådana fotavtryck verkligen representerar hela cellmembran ytan är fortfarande diskutabel^45,46,47. I detta avseende, tillåter med ett pH-känsliga färgämne som FITC-dextran och standard fluorescens Mikroskop eller confocal Mikroskop med ett öppet hål imaging av hela cellen, därmed fånga de totala exocytic händelser som inträffar i cellen.

Ytterligare pH-känsliga reportrar som används för att studera reglerade exocytos av hela cellen imaging eller TIRFM inkluderar SG last eller SG membranprotein smält till phlourin, en pH-känsliga GFP variant. Exempel är NPY – phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin och synapto-phluorin^{48,49,50,51,52}. Uttryck av dessa sonder kan representera närmare endogena sammansättningen av SGs, det innebär transfection celler medan kan därför vara mindre lämpligt för celler som är svåra att transfect. Därför, när studerar celler som är svåra att transfect eller under experimentella förhållanden som kräver flera genetiska manipulationer, är en förening som enkelt kan kompletteras i cell odlingsmediet, såsom FITC-dextran, fördelaktiga . FITC-dextran erbjuder också en fördel över akridin orange (AO), en annan pH-känsliga färgämne som har använts för spårning av exocytos av levande cell mikroskopi^{53,54,55,56 , 57 , 58}. AO har visats inducera fotolys av blåsor att resultera i falskt blixtar, som inte motsvarar faktiska sekretion bearbetar²⁷. I motsats därtill återspeglar FITC-dextran bättre utsöndring händelser, förmodligen på grund av dess låga foto-inducerad produktionen av reaktivt syre²⁷.

Noterbart är en alternativ metod för att studera exocytos av spårning tillströmningen av ett färgämne, från externa mediet till SG genom fusion pore som öppnas under denna process. I det här fallet läggs färgen till externa medium tillsammans med sekretoriska utlösaren. Sedan, när fusion porerna öppnas färgämnet diffunderar in i SG^59,60. En klar fördel med denna metod är att det också ger möjlighet att uppskatta fusion porstorlek, genom användning av färgämnen av varierande storlek. Exempelvis kan dextrans med olika molekylvikt (MW), konjugerat till olika fluorophores, användas som extracellulära färgämnen varvid den maximala storleken av dextran som kan penetrera SG skulle motsvara storleken på fusion pore^{59, 61 , 62 , 63 , 64}. Dessutom denna metod kräver inte användning av en pH-känsliga sond. En betydande nackdel är dock att signal-brusförhållande är mycket låg, eftersom en stor mängd färgämne är närvarande i media under förvärv av bilder, vilket resulterar i hög bakgrund.

Övergripande, användning av FITC-dextran som en markör för exocytos övervinner flera nackdelar i tidigare rapporterade metoder, såsom signal till brus förhållande, toxicitet, dynamisk spårning och komplexitet.

Här beskriver vi användningen av FITC-dextran att övervaka sammansatta exocytos i RBL – 2H 3 mast cell linje (hädanefter kallas RBL, primärt fastställt Eccleston o.a. ⁶⁵ och ytterligare klonade av Barsumian et al. ( ⁶⁶), som svar på immunglobulin E (IgE) / antigen (Ag) aktivering.

Protocol

1. förberedelser Beredning av RBL kultur media Blanda 500 mL låg glukos Dulbecco’s modified örnens medium (DMEM) med 56 mL fetalt bovint serum (FBS), 5,5 mL penicillin-streptomycin-nystatin lösning, 5,5 mL L-glutamin 200 mM lösning. Detta resulterar i låg glukos DMEM kompletteras med 10% FBS, 100 µg/mL streptomycin, 100 enheter/mL penicillin, 12 enheter/mL nystatin och 2 mM L-glutamin. Filtrera media med ett topp-vakuum filter 0,22 µm porstorlek och butik vid 4 ° C. …

Representative Results

Figur 1a representerar schematiskt hur FITC-dextran kan fungera som en reporter för reglerad exocytos och sammanfatta de olika lägena av exocytic händelser. Först, cellerna inkuberas med FITC-dextran, som är internaliserad av pinocytosis och sorteras till SGs. Eftersom SGs av MCs är LROs, deras låga pH dämpar fluorescensen FITC visas här som svart granulat (A-C, jag). När celler utlöses av en insulinsekretagog och SGs säkringen med plasmamembranet…

Discussion

Här beskriver vi hur spårning fluorescensen av FITC-dextran laddade i SGs kan användas för att specifikt fånga sammansatta exocytos händelser. Detta uppnåddes genom att ange mikroskopet till förvärva en bild var 15 sekunder, vilket säkerställer att endast långvarig händelser registreras över tid och därför exklusive kort händelser som skulle motsvara full exocytos eller kiss-och-kör exocytos. För att införa metoden, visade vi att Nedslagning av den Rab5-isoformer som uttrycks i RBL celler, och är avg…

Materials

DMEM low glucose	Biological Inductries	01-050-1A
Fetal bovine serum	Gibco	12657
Pen-strep-nystatin solution	Biological Inductries	03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution	Biological Inductries	03-020-1A
FITC dextran 150K	Sigma-Aldrich	46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B	Biological Inductries	03-052-1A	Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size	Sartorius	16534K
Chambered coverglass	Thermo scientific	155411
Corning tissue-culture treated culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430167
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503
Anti-DNP monoclonal IgE	Sigma-Aldrich	D8406
DNP-HSA (Ag)	Sigma-Aldrich	A6661	Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4	Biological Inductries	03-025-1B
CaCl2	MERK	102382
Glucose	BDH Laboratories	284515V
Ammonium chloride	MERK	1145
PIPES dipotassium salt	Sigma-Aldrich	108321-27-3
Calcium acetate hydrate	Sigma-Aldrich	114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate)	Sigma-Aldrich	G1501
NaH2PO4	MERK	6346
NaCl	MERK	106404
MgCl2	MERK	105833
KCl	MERK	104936
Electroporator	BTX	ECM830
Confocal microscope, Zeiss	Zeiss	LSM 5 Pascal, Axiovert 200M	Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss	Zeiss	LSM 800, Axio Observer.Z1 /7	Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled airstream incubator
Confocal microscope, Leica	Leica	SP5	Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells			RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67