यहां, हम लार्वा zebrafish और fathead छोटी मछली हरकत गतिविधियों और एक स्वचालित ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग photomotor प्रतिक्रियाओं (पीएमआर) की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । जब आम विषविज्ञान में शामिल परख, इन व्यवहार के विश्लेषण के लिए रासायनिक जैव गतिविधि की जांच करने के लिए एक नैदानिक उपकरण प्रदान करते हैं । इस प्रोटोकॉल कैफीन, एक मॉडल neurostimulant का उपयोग कर वर्णित है ।
मछली मॉडल और व्यवहार तेजी से जैव चिकित्सा विज्ञान में इस्तेमाल कर रहे हैं; हालांकि, मछली लंबे समय से पारिस्थितिक, शारीरिक और विषाक्तता अध्ययन का विषय रहा है । स्वचालित डिजिटल ट्रैकिंग प्लेटफार्मों का प्रयोग, neuropharmacology में हाल के प्रयासों लार्वा मछली हरकत व्यवहार लाभ के लिए उपंयास छोटे अणुओं के लिए संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान कर रहे हैं । इन प्रयासों के लिए इसी प्रकार, पर्यावरण विज्ञान और तुलनात्मक औषधि और विषविज्ञान में अनुसंधान के लिए मछली के मॉडलों के विभिंन व्यवहार की जांच कर रहा है उपकरणों के tiered मूल्यांकन में नैदानिक उपकरण और के लिए सतह के पानी की वास्तविक समय निगरानी contaminant धमकियां । जबकि zebrafish जैव चिकित्सा विज्ञान में एक लोकप्रिय लार्वा मछली मॉडल है, fathead छोटी मछली लार्वा में एक आम ecotoxicology मछली मॉडल है । दुर्भाग्यवश, fathead छोटी मछली लार्वा व्यवहारिक अध्ययनों में काफी कम ध्यान मिला है. यहां, हम विकसित करने और एक व्यवहार प्रोफ़ाइल एक मॉडल neurostimulant के रूप में कैफीन का उपयोग प्रोटोकॉल का प्रदर्शन । हालांकि fathead minnows के photomotor प्रतिक्रियाओं कभी-कभार कैफीन से प्रभावित थे, zebrafish photomotor और हरकत अंतिमबिंदु, जो पर्यावरण की दृष्टि से प्रासंगिक स्तरों पर प्रतिक्रिया के लिए चिह्नित रूप से अधिक संवेदनशील थे । भविष्य के अध्ययन के लिए उम्र और दिन के समय के साथ मछली के बीच तुलनात्मक व्यवहार संवेदनशीलता मतभेदों को समझने की जरूरत है, और निर्धारित करने के लिए कि क्या इसी तरह व्यवहार प्रभाव प्रकृति में घटित होता है और व्यक्ति पर प्रतिकूल परिणामों का संकेत हो या जैविक संगठन की जनसंख्या का स्तर ।
हालांकि मछली मॉडल तेजी से जैव चिकित्सा अध्ययन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, मछली नियमित रूप से पारिस्थितिकी और शरीर विज्ञान के अध्ययन के लिए कार्यरत है, सतह के पानी के संदूषण की जांच करने के लिए, और रसायनों की विषाक्तता थ्रेसहोल्ड को समझते हैं । इस तरह के प्रयासों महत्वपूर्ण है क्योंकि रासायनिक संक्रमण जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों ख़राब और स्रोत पानी की आपूर्ति1,2की गुणवत्ता ख़तरे में डालना कर सकते हैं । वाणिज्य में रसायनों के अधिकांश, तथापि, कमी भी बुनियादी विषविज्ञान जानकारी3।
पशु मॉडल पारंपरिक नियामक विषाक्तता परीक्षण में प्रयोग किया जाता परख संसाधन गहन और उच्च प्रवाह प्रदान नहीं कर सकते हैं, प्रारंभिक स्तरीय स्क्रीनिंग 21 वीं सदी में विषाक्तता परीक्षण के लिए आवश्यक4। बाद में, वहां एक बढ़ती प्रोत्साहन को अपनाने और इन विट्रो मॉडल है कि और अधिक तेजी से और कुशलता से जैविक गतिविधियों के लिए स्क्रीन यौगिकों3,5कर सकते है उपयोग है । हालांकि सेल आधारित मॉडल कई अवसर मौजूद हैं, वे अक्सर जैविक जटिलता की कमी है, और इस तरह कई महत्वपूर्ण पूरे जीव प्रक्रियाओं के लिए खाते में नहीं है, चयापचय सहित6।
zebrafish एक आम जैव चिकित्सा पशु मॉडल है कि जलीय विषविज्ञान और ecotoxicology7,8में एक वैकल्पिक मॉडल के रूप में लोकप्रियता प्राप्त कर रहा है । उनके छोटे आकार, तेजी से विकास, और उच्च fecundity को देखते हुए, मछली के मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है तेजी से और कुशलता से समग्र जीव9पैमाने पर प्रतिक्रिया और विषाक्तता के लिए रसायनों स्क्रीन । स्वचालित ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर की सहायता के साथ, लार्वा zebrafish व्यवहार विषाक्तता के लिए स्क्रीनिंग संदूषण में बढ़ाया नैदानिक उपयोगिता प्रदान करता है10,11. दवा विज्ञान में अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि हरकत अंतिमबिंदु कार्रवाई की रासायनिक तंत्र के जानकारीपूर्ण रहे हैं, phenotype व्यवहार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और फिर अंतरिम रूप से उपंयास अणुओं12के लिए सेलुलर लक्ष्यों की पहचान कर सकते हैं, 13. जबकि zebrafish जैव चिकित्सा विज्ञान में एक लोकप्रिय लार्वा मछली मॉडल है, fathead छोटी मछली एक आम, पारिस्थितिकी महत्वपूर्ण मछली मॉडल है कि ecotoxicology अध्ययन के लिए और भावी के दौरान प्रयोग किया जाता है (जैसे, नई रासायनिक मूल्यांकन) और पूर्वव्यापी (उदा., परिवेशी सतह जल या अपशिष्ट प्रवाह निर्वहन निगरानी) पर्यावरणीय आकलन । दुर्भाग्य से, लार्वा fathead minnows के व्यवहार प्रतिक्रियाओं zebrafish से स्पष्ट रूप से कम ध्यान मिला है । हमारे दो आम लार्वा मछली मॉडल, zebrafish और fathead छोटी मछली के साथ चल रहे अनुसंधान से पता चलता है कि लार्वा मछली तैराकी पैटर्न विविध रसायनों के लिए प्रत्याशित मोड या कार्रवाई के तंत्र के लिए अद्वितीय दिखाई देते हैं । इस प्रकार, व्यवहार अंतिमबिंदु तेजी से और संवेदनशील विषाक्तता के लिए रसायनों की जांच करने के लिए और औद्योगिक रासायनिक और अन्य पदार्थों के लिए उपसेलुलर लक्ष्यों की पहचान करने के लिए, विशेष रूप से प्रारंभिक स्तरीय आकलन के दौरान क्षमता प्रदान करते हैं ।
यहां, हम लार्वा मछली में व्यवहार प्रतिक्रिया प्रोफाइल की जांच के लिए एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट । हम इन कैफीन, एक मॉडल neurostimulant और एक आम जलीय contaminant है कि अपशिष्ट जल उपचार संयंत्रों से मुक्ति के माध्यम से जलीय प्रणालियों के लिए शुरू की है का उपयोग कर तरीकों का प्रदर्शन खाद्य पदार्थ, पेय पदार्थों के मानव उपभोग के बाद, और फार्मास्यूटिकल्स14कैफीन के साथ तैयार की । हम दोनों लार्वा zebrafish और fathead छोटी मछली, जिसमें अक्सर भ्रूण और photomotor के साथ दवा की पढ़ाई के दौरान एक पीएमआर प्रतिक्रिया (लार्वा) के रूप में जाना जाता है प्रकाश व्यवस्था में अचानक परिवर्तन करने के लिए सहित में कैफीन के लिए व्यवहार प्रतिक्रियाओं की जांच zebrafish13,15. हम आगे कई हरकत अंतिमबिंदु भर में कैफीन के प्रभाव की पहचान करने के लिए प्रत्येक मछली मॉडल के लिए रासायनिक प्रतिक्रिया प्रोफाइल विकसित करना । कैफीन उपचार का स्तर इस अध्ययन में इस्तेमाल किया जोखिम वितरण के ऊपरी centiles कैफीन16के मापा पर्यावरणीय मूल्यों के आधार पर प्रतिनिधित्व करते हैं । हम भी लार्वा मछली LC५० मूल्यों के लिए बेंचमार्क उपचार शामिल हैं, और चिकित्सीय जोखिम मूल्य (THV), पानी में एक दवा एकाग्रता है कि एक मानव चिकित्सीय प्लाज्मा खुराक के अनुरूप मछली में प्लाज्मा स्तर में परिणाम प्रत्याशित है ।
जब व्यवहार विषविज्ञान अध्ययन के लिए रासायनिक उपचार के स्तर का चयन, कई कारकों पर विचार किया जाना चाहिए । वर्तमान अध्ययन में कैफीन उपचार स्तर अपशिष्ट प्रवाह16से अनुमानित पर्यावरणीय जोखिम परिदृश्यों के लिए ऊपरी centile मूल्यों के आधार पर चयन किया गया । जब संभव हो, हम नियमित रूप से जलीय विषविज्ञान अध्ययन के लिए उपचार के स्तर का चयन पर्यावरण प्रेक्षणों के संभाव्य जोखिम आकलन19,20,21। एक THV, जो दवाओं के लिए calculable है, को भी वर्तमान अध्ययन में उपचार स्तर के रूप में शामिल किया गया था । THV मान (Eq .1)22,23 की भविष्यवाणी की जल सांद्रता के रूप में परिभाषित कर रहे हैं23मछली में मानव चिकित्सीय खुराक (सीमैक्स) फार्मास्यूटिकल्स के लिए अग्रणी, प्रारंभिक प्लाज्मा मॉडलिंग24प्रयासों से प्रेरित कर रहे हैं, और कर रहे हैं रक्त के आधार पर गणना: जल रासायनिक विभाजन गुणांक (Eq .2)25.
THV = Cमैक्स /लॉग PBW (Eq .1)
लाग PBW = लाग [(10०.७३. log Kow · 0.16) + 0.84] (Eq .2)
यहां, हम भी zebrafish और fathead छोटी मछली LC50 मूल्यों के सापेक्ष घातक उपचार के स्तर का चयन करें । हम इस दृष्टिकोण व्यवहार प्रतिक्रियाओं के लिए एक उपयोगी बेंचमार्किंग प्रक्रिया पर विचार, विशेष रूप से जब कई रसायनों भर में एक मछली मॉडल के साथ विशिष्ट व्यवहार की थ्रेसहोल्ड की तुलना. यह आगे जीर्ण अनुपात के लिए तीव्र की गणना की सुविधा है, जो नैदानिक यंत्रवत अध्ययन और आकलन के लिए जलीय विषविज्ञान में उपयोगी हो सकता है । LC50 मूल्यों प्रारंभिक विषाक्तता से मानकीकृत कदम २.१ में दिए गए दिशा निर्देशों का पालन परख प्राप्त किए गए ।
इस प्रोटोकॉल में, हम आम प्रयोगात्मक डिजाइन और सांख्यिकीय मछली मॉडल के साथ विषविज्ञान अध्ययन के लिए अमेरिका EPA और ओईसीडी मानकीकृत तरीकों से सिफारिश की तकनीक को रोजगार । यद्यपि हम p मानों (उदा., < 0.01, < 0.05, < 0.10) की रिपोर्ट करते हैं, गतिविधि स्तरों में महत्वपूर्ण अंतर (α = ०.१०), प्रसरण (ANOVA) के विश्लेषण का उपयोग करके उपचार के बीच पहचाना जाता है यदि सामांयता और प्रसरण मान्यताओं का तुल्य मिले हैं । Dunnett है या Tukey के एचएसडी पोस्ट हॉक परीक्षण उपचार स्तर मतभेदों की पहचान करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं । हम इस अल्फा का चयन करें (α = ०.१०) मूल्य प्रकार द्वितीय त्रुटियों को कम करने के लिए, विशेष रूप से जल्दी स्तरीय परख के लिए और जब जैविक रूप से महत्वपूर्ण प्रभाव आकार की समझ के लिए सीमित है अध्ययन व्यवहार अंतिमबिंदु और मॉडल जीव26, के बजाय कई तुलना के लिए जैव चिकित्सा विज्ञान में और अधिक आम प्रक्रियाओं को रोजगार (जैसे, आरएनए के लिए Bonferroni सुधार-Seq डेटा)27. भविष्य के अध्ययन के लिए इन व्यवहार प्रतिक्रियाओं की परिवर्तनशीलता को समझने की जरूरत है और संभवतः प्रयोगात्मक डिजाइन (जैसे, वृद्धि प्रतिकृति) तदनुसार संशोधित ।
कारकों की एक संख्या रासायनिक जोखिम के अलावा लार्वा मछली के व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, दिन के समय, उंर, अच्छी तरह से आकार, तापमान, प्रकाश व्यवस्था की स्थिति, और जोखिम समाधान की मात्रा में एक अच्छी तरह से महत्वपूर्ण विचार11,30प्रतिनिधित्व करते हैं । इन कारणों के लिए, सावधानियों बाह्य कारकों है कि प्रयोग के दौरान लार्वा मछली के हरकत व्यवहार को प्रभावित कर सकता है के प्रभाव को कम करने के लिए लिया जाना चाहिए । व्यवहार प्रेक्षणों संकीर्ण समय windows में किया जाना चाहिए (3 से 4 ज) और समय अवधि के पार जब दिन के प्रभाव के समय लार्वा हरकत व्यवहार11पर ंयूनतम प्रभाव है की उंमीद कर रहे हैं । इसके अतिरिक्त, लार्वा मछली एक सुसंगत तापमान पर बनाए रखा जाना चाहिए (zebrafish के लिए 28 ± 1 ° c और FHM के लिए 24 ± 1 ° c) और एक परिभाषित प्रकाश पर जोखिम अवधि भर में तापमान नियंत्रित करने वाली इसके अलावा, जहां व्यवहार दर्ज कर रहे है प्रयोगशाला के तापमान व्यवहार पर तापमान प्रभावों से बचने के लिए प्रयोगात्मक शर्तों approximating शर्तों को बनाए रखा जाना चाहिए । इसके अलावा, कुओं व्यवहार टिप्पणियों के दौरान इस्तेमाल किया प्रत्येक व्यक्ति मछली के लिए एक सुसंगत मात्रा में बनाए रखा जाना चाहिए ।
लार्वा और भ्रूण zebrafish PMRs पहले जैव चिकित्सा विज्ञान में इस्तेमाल किया गया है उपंयास यौगिकों12,13के लिए संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान । इस प्रोटोकॉल पर्यावरण संदूषणों की रासायनिक जैव गतिविधि की जांच करने के लिए ३८ अंतिमबिंदु का उपयोग करके zebrafish के साथ पिछले व्यवहार अनुसंधान पर फैलता है । हालांकि कैफीन कार्रवाई (मुआ) के एक समझ तंत्र के साथ एक आम जलीय contaminant है, वाणिज्य में कई यौगिकों महत्वपूर्ण यंत्रवत डेटा की कमी है । इसलिए, इस प्रोटोकॉल के लिए MoAs की अंतर्दृष्टि लाभ के लिए नियोजित किया जा सकता है विषाक्त पदार्थों की कमी डेटा, वाणिज्यिक रसायन सहित३९। इसके अलावा, प्रोटोकॉल सबसे अधिक इस्तेमाल किया मछली मॉडलों में से दो के लिए तरीके प्रदान करता है । जैसा कि पहले उल्लेख किया है, जबकि zebrafish एक आम जैव चिकित्सा मछली मॉडल है कि ecotoxicology में तेजी से लोकप्रिय होता जा रहा है, fathead छोटी मछली सामांयतः पर्यावरण आकलन अनुप्रयोगों के लिए एक पारिस्थितिकी मॉडल के रूप में इस्तेमाल होता है, लेकिन प्राप्त है zebrafish की तुलना में स्वचालित प्रणालियों के साथ व्यवहारिक अध्ययनों में तुलनात्मक रूप से कम ध्यान दिया जाता है । हालांकि मछली व्यवहार विषविज्ञान अध्ययन के लिए कोई मानकीकृत विनियामक तरीकों रहता है, इस प्रोटोकॉल एक दृष्टिकोण के लिए भविष्य के प्रयासों का समर्थन प्रदान करता है ।
कैफीन स्तर है कि जलीय पर्यावरण16में पाया गया है पर मछली मॉडल में से प्रत्येक में व्यवहार प्रतिक्रियाओं को मिलाया । Rodriguez-गिल एट अल. २०१८ कैफीन16के मापा मूल्यों के आधार पर जलीय प्रणालियों में वैश्विक पर्यावरण जोखिम वितरण विकसित की है । विशेष रूप से, अनुमानित अपशिष्ट प्रवाह सांद्रता के ९५% zebrafish और fathead छोटी मछली के सबसे संवेदनशील व्यवहार अंतिमबिंदु के लिए LOECs नीचे वर्तमान अध्ययन (तालिका 2) में गिर जाएगी । हालांकि कैफीन के कई व्यवहार प्रभाव zebrafish में देखा गया (विशेष रूप से अंधेरे परिस्थितियों में) पर्यावरण की दृष्टि से प्रासंगिक स्तर पर, यह स्पष्ट नहीं है कि इन व्यवहार संशोधनों प्राकृतिक मछली आबादी या परिणाम में हो सकता है पारिस्थितिकी महत्वपूर्ण प्रतिकूल परिणाम । हालांकि संवेदनशील, नैदानिक जांच प्रयोजनों के लिए उपयोगी है, लार्वा मछली व्यवहार थ्रेसहोल्ड अंय जीवन के इतिहास के चरणों या प्राकृतिक आबादी में मछली के प्रतिनिधि नहीं हो सकता है । इसके अलावा अनुसंधान के लिए निर्धारित है कि क्या समान व्यवहार प्रतिक्रिया थ्रेसहोल्ड प्रकृति में घटित होता है और व्यक्ति या जैविक संगठन के जनसंख्या स्तर पर प्रतिकूल परिणामों का संकेत होगा वारंट है ।
The authors have nothing to disclose.
अमेरिका के पर्यावरण संरक्षण एजेंसी से अतिरिक्त सहायता के साथ इस अध्ययन के लिए समर्थन अमेरिका के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (परियोजना #: चे-१३३९६३७) द्वारा प्रदान किया गया था । हम जनरल लैब समर्थन के लिए डॉ जॉन्ग Corrales, डॉ लॉरेन Kristofco, गेविन सारि, शमूएल Haddad, Bekah Burket और Bridgett हिल धंयवाद ।
ViewPoint Zebrabox | ViewPoint | ZebraLab and ZebraLab platform for automated behavioral observations | |
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-100G | Study chemical |
Incubator | VWR | 9110589 | Maintains light/dark cycle and temperature for fathead minnow experiments |
Incubator | Thermo Fisher Scientific | 35824-636 | Maintains light/dark cycle and temperature for zebrafish experiments |
100 ml glass beakers | VWR | 89000-200 | Zebrafish exposure chambers |
500 ml glass beakers | Pyrex | EW-34502-03 | Fathead minnow exposure chambers |
5000 µl auto-pipette | Eppendorf | Research 5000 | Used to fill individual wells in well plates |
Transfer Pippettes | VWR | 414-004-004 | Used to transfer study organisms |
48-well plates | Fisher Scientific | 08-772-52 | Larval zebrafish behavioral recording chambers |
24-well plates | VWR | 10062-896 | Larval fathead minnow behavioral recording chambers |
Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | For reconstituted hard water |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | For reconstituted hard water |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | For reconstituted hard water |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For reconstituted hard water |
z-mod recirculating system | Marine Biotech Systems | Recirculating system to maintian zebrafish cultures | |
Statistical analysis software | Sigma Plot | Version 13.0 | Used to analyze beahvioral data and produce figures |
Statistical analysis software | Graphpad Prism | Prism 5 | Used to produce figures |
Autosampler/quaternary pumping system | Agilent Technologies | Infinity 1260 model | Analytical verification of caffeine treatment levels |
Jet stream thermal gradient electrospray ionization source | Agilent Technologies | Analytical verification of caffeine treatment levels | |
Triple quadrupole mass analyzer | Agilent Technologies | Model 6420 | Analytical verification of caffeine treatment levels |
10 cm × 2.1 mm Poroshell 120 SB-AQ column (120Å, 2.7) | Agilent Technologies | 685775-914T | Caffiene chromatography |
MassHunter Optimizer Software | Agilent Technologies | Determine the ionization mode, monitored transitions, and instrumental parameters for caffeine/caffeine-d9 and paraxanthine/paraxanthine-d6 |