Digital PCR för kvantifiering av cirkulerande mikroRNA i akut hjärtinfarkt och hjärt-kärlsjukdom

Summary

Cirkulerande mikroRNA har visat lovande resultat som biomarkörer för hjärt-kärlsjukdomar och akut hjärtinfarkt. I denna studie beskriver vi ett protokoll för miRNA utvinning, omvänd Transkription och digital PCR för absolut kvantifiering av MicroRNA i serum hos patienter med kardiovaskulär sjukdom.

Abstract

Cirkulerande serum mikroRNA (Mirna) har visat lovande resultat som biomarkörer för kardiovaskulär sjukdom och akut hjärtinfarkt (AMI), släpps ut från hjärt-celler i cirkulationen. Cirkulerande MicroRNA är mycket stabila och kan kvantifieras. Det kvantitativa uttrycket för specifika MicroRNA kan kopplas till patologi, och vissa MicroRNA Visa hög vävnad och sjukdom specificitet. Att finna nya biomarkörer för hjärt-kärlsjukdomar är av betydelse för medicinsk forskning. Digitala polymeras-kedjereaktion (dPCR) har helt nyligen uppfunnits. dPCR, kombinerat med fluorescerande hydrolys sonder, kan särskild direkt absolut kvantifiering. dPCR uppvisar överlägsna tekniska egenskaper, inklusive en låg variabilitet, hög linjäritet och hög känslighet jämfört med kvantitativa polymeras-kedjereaktion (qPCR). DPCR är således en mer exakt och reproducerbar metod för direkt kvantifiering MicroRNA, särskilt för användning i stora multicenter hjärt-kliniska prövningar. I denna publikation beskriver vi hur du effektivt utför digital PCR för att bedöma antalet absoluta kopia i serumprov.

Introduction

Cirkulerande MicroRNA har identifierats som lovande markörer för ett antal sjukdomar, däribland hjärt-kärlsjukdom¹. MicroRNA är små, icke-kodande enkelsträngat RNA molekyler (cirka 22 nukleotider långa) är inblandade i den post-transcriptional förordning via ändring av budbärar-RNA översättning och påverkande gene expression², och släpps ut i cirkulationen i både fysiologiska och patologiska stater. Det kvantitativa uttrycket för specifika MicroRNA kan kopplas till patologin och vissa MicroRNA Visa hög vävnad och sjukdom specificitet¹. I hjärt-kärlsjukdomar, har MicroRNA blivit attraktiva kandidater som nya biomarkörer eftersom de är anmärkningsvärt stabil i serum och kan enkelt kvantifieras med hjälp av PCR-metod³. Det potentiella värdet av MicroRNA som biomarkörer för hjärtinfarkt har utvärderats i mindre studier, men en validering i stora kohorter saknas². Till exempel miR-499 finns starkt uttryckt i hjärtinfarkt muskeln, och det har visat sig öka avsevärt i en AMI^4,5,6. Ytterligare, det reglerar programmerad celldöd (apoptos) och differentiering av hjärtmuskelceller och således är involverad i flera mekanismer efter en AMI⁷. Bortsett från några små studier rapporterar en överlägsenhet och tillkommande värdet av MicroRNA för diagnos av AMI, har den överlägsenhet eller jämställdhet till hög känslighet hjärt troponins inte ännu bevisat i storskaliga studier^{2,5 ,6,8}. Fler prospektiva studier i stora kohorter, därför behövs för att bedöma potentiella diagnostiska värdet av microRNA. Dessutom metoder miRNA rapporteringsgräns behöver optimeras och standardiserade med jämförbara protokoll⁹. Standardiserade analyser kan minska inkonsekventa resultat och kan hjälpa MicroRNA att bli potentiella biomarkörer för rutinmässig klinisk tillämpning, som biomarkörer behöver kvantifieras på ett reproducerbart sätt att säkerställa deras kliniska tillämpligheten.

DPCR har nyligen införts som en slutpunkt analys. Det partitioner provet till ungefärligt 20.000 enskilda reaktioner¹⁰. DPCR systemet utnyttjar sedan en matematisk Poisson statistisk analys av fluorescerande signaler (positiva och negativa reaktioner), möjliggör en absolut kvantifiering utan en standardkurva¹⁰. När man kombinerar dPCR med fluorescerande hydrolys sonder, är mycket specifika direkt absolut kvantifiering av MicroRNA möjlig. Digitala polymeraskedjereaktion har visat för att uppvisar överlägsna tekniska egenskaper (inklusive en minskad variabilitet, en ökad dagliga reproducerbarhet, en hög grad av linjäritet och hög känslighet) för att kvantifiera miRNA nivåer i den omsättning jämfört med kvantitativ realtids PCR-^10,11. Dessa överlägsna tekniska egenskaper kan bidra till att mildra nuvarande begränsningar med cirkulerande MicroRNA som biomarkörer och kan leda till inrättandet av MicroRNA som biomarkörer i stora multicenter hjärt-kliniska prövningar och som en diagnostisk metod i Allmänt. I en tidigare studie, vi nyligen tillämpas dPCR för absolut kvantifiering av cirkulerande MicroRNA hos patienter med en AMI och kunde påvisa överlägsen diagnostisk potential jämfört med kvantifiering av MicroRNA av qPCR¹².

I denna publikation vill vi visa att använda dPCR är en exakt och reproducerbar metod för direkt kvantifiering av cirkulerande kardiovaskulära microRNA. Absolut kvantifiering av miRNA nivåer i serum, använder digital PCR, visar potential för användning i stora multicenter hjärt-kliniska prövningar. I den här skriften beskriver vi i detalj hur du effektivt utför digital PCR och hur man upptäcker absoluta miRNA kopienumret i serum.

Protocol

1. utvinning av miRNA från Plasma/Serum Obs: För att kvantifiera MicroRNA på lämpligt sätt, rätt mikroRNA isolering från plasma/serum är ett avgörande steg. En viktig sak att komma ihåg, särskilt eftersom olika protokoll finns, är att följa samma arbetsflöde vid bearbetning av proverna. I detta protokoll ur miRNA 50 µL serum. Använd inte mer än 200 µL som denna gräns rätta extraheringen. Förbereda serum eller Tina frysta prover. Lägga till 250 µL (5 v…

Representative Results

Digital PCR kombinerat med fluorescerande hydrolys sonder gör det möjligt för forskare att direkt beräkna den absoluta mängden särskilda MicroRNA i kopior/μl. Som provet i dPCR är partitionerad i ungefärligt 20.000 enskilda PCR-reaktioner, dPCR inte kräver tekniska replikerar10. DPCR systemet utnyttjar en matematisk Poisson statistisk analys av fluorescerande signaler (skiljer sig mellan positiva och negativa reaktioner) möjliggör en absolut kvantifieri…

Discussion

Digital PCR är en relativt ny slutpunkten metod av PCR som tillåter direkt absolut kvantifiering av nukleinsyror inom ett urval. Metoden besitter speciella fördelar, inklusive en minskad variabilitet, en ökad dagliga reproducerbarhet och en överlägsen känslighet^11,12. Vidare, på grund av uppdelningen av provet till ungefärligt 20.000 enda reaktioner och endpoint analyser, dPCR är mer robust till interfererande substanser i PCR jämfört med kvantitativ …

Materials

RNA-Extraction
miRNeasy Serum/Plasma Kit (50)	Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland	217184	Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript)  and RPE (called number two in manuscript).
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol	Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland	219610	Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'
Reverse Transcription
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4366597	Kit for microRNA reverse transcription
TaqMan MicroRNA Assays M	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assays used in reverse transcription
hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assay Number 001352
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assay Number 000200
PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	AB0900	96 well plate for reverse transcription
Microseal ‘B’ seal Seals	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	MSB1001	Foil to ensure proper storage
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1851196	Cycler used for reverse transcription
Droplet Digital PCR
100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p	Integrated DNA Technologies	Custom	Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863024	Supermix used in droplet generation
TaqMan MicroRNA Assays	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe)
hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assay Number 001352, commercial primers
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assay Number 000200, commercial primers
DG8 Cartridges and Gaskets	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1864007	Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation
DG8 Cartridge Holder	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863051	Holds cartridges in droplet generation
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863005	Oil used in droplet generation
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	12001925	96 well plate for ddPCR
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1814040	Pierceable foil, compatible with droplet reader
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863004	Oil used in droplet reading
QX100 or QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863002	Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1814000	Seals the plate before PCR
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1851196	Cycler used for ddPCR
QX100 or QX200 Droplet Reader	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863003	Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector
ddPCR Buffer Control for Probes	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863052	Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette
Software
QuantaSof Software	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1864011	Program for droplet reading
Prism Windows 5	GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA		Program for statistical analysis