Isolatie van atriale Cardiomyocytes van een Rat Model van metabole syndroom-gerelateerde hartfalen met bewaarde ejectie Fractie
Summary
Hier beschrijven we een geoptimaliseerd, Langendorff gebaseerde procedure voor de isolatie van eencellige atriale cardiomyocytes van een rat model van metabole syndroom-gerelateerde hartfalen met bewaarde ejectie Fractie. Een handmatige regulering van de intraluminale druk van cardiale Holten is geïmplementeerd om de opbrengst van functioneel intact myocytes geschikt voor excitatie-contractie-koppeling studies.
Abstract
In dit artikel beschrijven we een geoptimaliseerd, Langendorff gebaseerde procedure voor de isolatie van eencellige atriale cardiomyocytes (ACMs) van een rat model van metabool syndroom (MetS)-gerelateerde hartfalen met bewaarde ejectie fractie (HFpEF). De prevalentie van MetS-gerelateerde HFpEF stijgt en atriale hartziekten atriale remodelleren en boezemfibrilleren is gekoppeld zijn klinisch relevant als atriale remodelleren een onafhankelijke voorspeller voor mortaliteit is. Studies met geïsoleerde eencellige cardiomyocytes worden vaak gebruikt als aanvulling op de in vivo bevindingen te bevestigen. Bloedsomloop vaartuig rarefication en interstitiële weefsel fibrose vormen een potentieel beperkende factor voor de succesvolle eencellige isolatie van ACMs uit dierlijke modellen van deze ziekte.
Wij hebben deze kwestie behandeld door gebruik te maken van een apparaat staat handmatig het reguleren van de intraluminale druk van cardiale Holten tijdens de procedure van de isolatie, de opbrengst van morfologisch en functioneel intact ACMs aanzienlijk te verhogen. De verworven cellen kunnen worden gebruikt in een verscheidenheid van verschillende experimenten, zoals de celcultuur en functionele beeldvorming van de Calcium (d.w.z., excitatie-contractie-koppeling).
Wij bieden de onderzoeker met een stapsgewijze protocol, een lijst van geoptimaliseerde oplossingen, grondige instructies ter voorbereiding van de nodige apparatuur en een uitgebreide gids voor probleemoplossing. Terwijl de eerste uitvoering van de procedure zou nogal moeilijk zijn, kan een succesvolle aanpassing de lezer voor het uitvoeren van state-of-the-art ACM isolatie in een rat model van MetS-gerelateerde HFpEF voor een breed spectrum van experimenten.
Introduction
MetS b eschrijving van een cluster van risicofactoren voor diabetes mellitus type 2 en hart-en vaatziekten en een verhoogde arteriële bloeddruk, dyslipidemia (triglyceriden verhoogd en verlaagd van high-density lipoprotein cholesterol), verhoogd vasten glucose en centrale obesitas1. De wereldwijde prevalentie van MetS wordt geschat op 25-30% en de voortdurend stijgende2. HFpEF is een heterogene klinisch syndroom vaak geassocieerd met MetS. De cardiale remodelleren tijdens HFpEF en de voorafgaande fasen (d.w.z., Hypertensieve hartziekte) gaat ook gepaard met een verbouwing van de atria3. Verminderde contractiele functie en structurele veranderingen in de linkerboezem zijn geassocieerd met verhoogde mortaliteit, boezemfibrilleren en nieuwe-onset hartfalen4. Atriale remodelleren wordt gekenmerkt door veranderingen in het ion kanaal functie, Ca2 + homeostase, atriale structuur, fibroblast activering en weefsel fibrose5. Links atriale remodelleren in MetS-gerelateerde HFpEF en de bijbehorende onderliggende pathologische mechanismen zijn nog slecht begrepen en een meer diepgaand onderzoek vereist is. Dierlijke modellen hebben bewezen een waardevol instrument zijn en leiden tot vele ontwikkelingen op het gebied van atriale hartziekten6,,7,,8,9.
Studies met geïsoleerde eencellige cardiomyocytes worden vaak gebruikt als aanvulling op de in vivo bevindingen te bevestigen. Een isolatie, en de mogelijke latere celcultuur, zorgen voor het onderzoek van signalering van trajecten, Ionische kanaal stromingen en excitatie-contractie-koppeling. Cardiomyocytes onder fysiologische omstandigheden, niet verspreiden. De fusie tussen de transcriptionele regulerende sequenties atrial natriuretic factor en een simian 40 grote T virusantigeen in transgene muizen leidde tot de oprichting van de eerste vereeuwigd ACMs, AT-110genoemd. De verdere ontwikkeling van de cellen van de AT-1 gaf aanleiding tot HL-1 cellen, die niet kunnen alleen serieel worden gepasseerd maar ook contract spontaan11. Ze vertonen echter structurele en functionele verschillen in vergelijking met vers geïsoleerde cellen, zoals een minder georganiseerde ultrastructuur, een hoge voorkomen van de ontwikkeling van myofibrils11, en een hyperpolarisatie-geactiveerde innerlijke huidige12. Het isolement van ventriculaire cardiomyocytes (VCM) bij ratten en muizen uit een verscheidenheid van modellen is goed ingeburgerd13,14,15,16,17,18 , 19. in het algemeen de verwijderde hart is gemonteerd op een Langendorff apparatuur en retrogradely met een Ca2 +geperfundeerd-gratis buffer met spijsverteringsenzymen, zoals collagenases en proteasen. Calcium is vervolgens opnieuw op een stapsgewijze manier aan de fysiologische omstandigheden. Hoewel de protocollen die zijn gewijd aan het isolement van ACMs zijn beschikbaar van20,21, als gevolg van de toegenomen fibrose en druk-gerelateerde verschillen, is hun nut in ziekte modellen met atriale remodelleren echter beperkt.
In dit artikel, hebben we een protocol voor de isolatie van atriale eencellige cardiomyocytes van dieren die atriale remodelleert (dat wil zeggen, in het bijzonder voor de ZFS1 rat model voor MetS-gerelateerde HFpEF)22 vertonenuitgevoerd. Bestaande protocollen van de isolatie waren geoptimaliseerd en aangevuld met een eenvoudige, op maat gemaakte apparaat om te controleren en wijzigen van de intraluminale druk van de cardiale Holten, wat leidt tot hogere opbrengsten van morfologisch en functioneel intact cardiomyocytes. Het volgende protocol biedt de onderzoeker met een stapsgewijze gids, een gedetailleerde beschrijving van de op maat gemaakte apparatuur, een lijst van oplossingen, evenals een uitgebreide gids voor probleemoplossing.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier, we voor het eerst beschreven een protocol voor de isolatie van eencellige ACMs van een rat model van MetS-gerelateerde HFpEF die toont atriale remodelleert22gemarkeerd. De procedure is een unieke uitdaging als overmatig vetweefsel de chirurgische voorbereiding, evenals de cannulation van de aorta, steeds moeilijker maken kan. De gids voor probleemoplossing gegeven in tabel 2 adressen de meest voorkomende problemen van de isolatie-procedure.
<table border="1" fo:keep-toge…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door de DZHK (Duitse centrum voor cardiovasculair onderzoek, DB), de EKFS (Else-Kröner-Fresenius Stiftung, F.H.), en door de goedgekeurd (Duitse ministerie van onderwijs en onderzoek), evenals de BIH-Charité klinische wetenschapper programma gefinancierd door de Charité – Universitätsmedizin Berlijn en de Berlijnse Institute of Health (F.H.).
Materials
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
- Alberti, K. G., et al. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity. Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).
- . IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome Available from: https://www.idf.org/e-library/consensus-statements/60-idfconsensus-worldwide-definitionof-the-metabolic-syndrome.html (2006)
- Melenovsky, V., et al. Left atrial remodeling and function in advanced heart failure with preserved or reduced ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 8 (2), 295-303 (2015).
- Goette, A., et al. EHRA/HRS/APHRS/SOLAECE expert consensus on atrial cardiomyopathies: definition, characterization, and clinical implication. EP Europace. 18 (10), 1455-1490 (2016).
- Schotten, U., Verheule, S., Kirchhof, P., Goette, A. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiological Reviews. 91 (1), 265-325 (2011).
- Hohendanner, F., DeSantiago, J., Heinzel, F. R., Blatter, L. A. Dyssynchronous calcium removal in heart failure-induced atrial remodeling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (6), H1352-H1359 (2016).
- Hohendanner, F., et al. Inositol-1,4,5-trisphosphate induced Ca2+ release and excitation-contraction coupling in atrial myocytes from normal and failing hearts. The Journal of Physiology. 593 (6), 1459-1477 (2015).
- Tada, Y., et al. Role of mineralocorticoid receptor on experimental cerebral aneurysms in rats. Hypertension. 54 (3), 552-557 (2009).
- Iwasaki, Y. K., et al. Atrial fibrillation promotion with long-term repetitive obstructive sleep apnea in a rat model. Journal of the American College of Cardiology. 64 (19), 2013-2023 (2014).
- Field, L. J. Atrial natriuretic factor-SV40 T antigen transgenes produce tumors and cardiac arrhythmias in mice. Science. 239 (4843), 1029-1033 (1988).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Sartiani, L., Bochet, P., Cerbai, E., Mugelli, A., Fischmeister, R. Functional expression of the hyperpolarization-activated, non-selective cation current I(f) in immortalized HL-1 cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 545 (Pt 1), 81-92 (2002).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Gunduz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357 (2014).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50289 (2013).
- Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (91), e51109 (2014).
- Thum, T., Borlak, J. Isolation and cultivation of Ca2+ tolerant cardiomyocytes from the adult rat: improvements and applications. Xenobiotica. 30 (11), 1063-1077 (2000).
- Egorova, M. V., Afanas’ev, S. A., Popov, S. V. A simple method for isolation of cardiomyocytes from adult rat heart. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 140 (3), 370-373 (2005).
- Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments. (92), e51823 (2014).
- Hohendanner, F., et al. Cellular mechanisms of metabolic syndrome-related atrial decompensation in a rat model of HFpEF. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 115, 10-19 (2017).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), e2033 (2010).
- Bootman, M. D., Higazi, D. R., Coombes, S., Roderick, H. L. Calcium signalling during excitation-contraction coupling in mammalian atrial myocytes. Journal of Cell Science. 119 (Pt 19), 3915-3925 (2006).
- Smyrnias, I., et al. Comparison of the T-tubule system in adult rat ventricular and atrial myocytes, and its role in excitation-contraction coupling and inotropic stimulation. Cell Calcium. 47 (3), 210-223 (2010).
- Pritchett, A. M., et al. Diastolic dysfunction and left atrial volume: a population-based study. Journal of the American College of Cardiology. 45 (1), 87-92 (2005).
- Linz, D., et al. Cathepsin A mediates susceptibility to atrial tachyarrhythmia and impairment of atrial emptying function in Zucker diabetic fatty rats. Cardiovascular Research. 110 (3), 371-380 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. 생화학. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Deel, E. D., et al. In vitro model to study the effects of matrix stiffening on Ca(2+) handling and myofilament function in isolated adult rat cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 595 (14), 4597-4610 (2017).
- Wuensch, E., Heidrich, H. G. [On the Quantitative Determination of Collagenase]. Hoppe-Seyler’s Zeitschrift für physiologische Chemie. 333, 149-151 (1963).
- Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
- Horgan, S., Watson, C., Glezeva, N., Baugh, J. Murine models of diastolic dysfunction and heart failure with preserved ejection fraction. Journal of Cardiac Failure. 20 (12), 984-995 (2014).
