Isolering av förmaksflimmer hjärtmuskelcellerna från en råtta modell av metabola syndromet-relaterade hjärtsvikt med bevarad ejektionsfraktion
Summary
Här beskriver vi en optimerad, av-baserat förfarande för isolering av encelliga förmaksflimmer hjärtmuskelcellerna från en råtta modell av metabola syndromet-relaterade hjärtsvikt med bevarad ejektionsfraktion. En manuell reglering för intraluminal tryck av hjärtats hålrum implementeras för att ge funktionellt intakt myocyter passar excitation-contraction-koppling studier.
Abstract
I den här artikeln beskriver vi en optimerad, av-baserat förfarande för isolering av encelliga förmaksflimmer hjärtmuskelcellerna (ACMs) från en råtta modell av metabola syndromet (MetS)-relaterade hjärtsvikt med bevarad ejektionsfraktion (HFpEF). Prevalensen av MetS-relaterade HFpEF stiger, och förmaksflimmer kardiomyopati förknippas med förmaksflimmer remodeling och förmaksflimmer är kliniskt relevanta som förmaksflimmer remodeling är en oberoende prediktor för dödlighet. Studier med isolerade encelliga hjärtmuskelcellerna används ofta att bekräfta och komplettera i vivo fynd. Cirkulatorisk fartyg rarefication och interstitiell vävnad fibros utgör ett potentiellt begränsande faktor för framgångsrik enskild cell isolering av ACMs från djurmodeller av denna sjukdom.
Vi har tagit upp denna fråga genom att anställa en enhet kan manuellt reglera intraluminal trycket av hjärtats hålrum under förfarandet för isolering, väsentligt öka avkastningen av morfologiskt och funktionellt intakt ACMs. De förvärvade cellerna kan användas i en mängd olika experiment, såsom cellkultur och funktionell kalcium-imaging (dvs, excitation-contraction-koppling).
Vi ge forskaren en stegvisa protokollet, en lista med optimerade lösningar, grundliga instruktioner att förbereda nödvändig utrustning, och en omfattande felsökningsguide. Medan den inledande tillämpningen av förfarandet kan vara ganska svårt, kommer att en lyckad anpassning låta läsaren att utföra state-of-the-art ACM isoleringar i en råtta modell av MetS-relaterade HFpEF för ett brett spektrum av experiment.
Introduction
MetS beskriver ett kluster av riskfaktorer för diabetes mellitus typ 2 och hjärt-kärlsjukdomar och innehåller ett ökat arteriellt blodtryck, dyslipidemi (höjas triglycerider och sänkas high-density lipoprotein kolesterol), ökade fasta glukos och central fetma1. Världen över prevalensen av MetS uppskattas till 25 – 30% och ständigt stigande2. HFpEF är en heterogen kliniska syndrom som ofta förknippas med MetS. Den kardiella remodeling under HFpEF och dess föregående faser (dvs, Hypertensiv hjärtsjukdom) åtföljs av en ombyggnad av atria3. Nedsatt kontraktila funktion och strukturella förändringar av vänster förmak har förknippats med ökad dödlighet, förmaksflimmer och hjärtsvikt nydebuterade4. Förmaksflimmer remodeling kännetecknas av förändringar i den kanal Jonfunktionen, Ca2 + homeostas, förmaksflimmer struktur, fibroblast aktivering och vävnad fibros5. Vänster förmak remodeling i MetS-relaterade HFpEF och dess underliggande patologiska mekanismer är fortfarande bristfällig och kräver en ytterligare fördjupad undersökning. Djurmodeller har visat sig vara ett värdefullt verktyg och leda till många framsteg i fältet förmaksflimmer kardiomyopatier6,7,8,9.
Studier med isolerade encelliga hjärtmuskelcellerna används ofta att bekräfta och komplettera i vivo fynd. En isolering och eventuella efterföljande cellkulturen, tillåta för utredning av signalering vägar, Joniska kanal strömmar och excitation-contraction-koppling. Under fysiologiska tillstånd, hjärtmuskelceller inte föröka. Fusion mellan de transkriptionell reglerande sekvenserna av en atrial natriuretic factor och en simian virus 40 stora T-antigen i transgena möss ledde till skapandet av de första förevigade ACMs, heter AT-110. Vidareutveckling av AT-1 celler gav upphov till HL-1 celler, som kan inte bara vara seriellt passaged men också kontrakt spontant11. De gör, dock visar strukturella och funktionella skillnader jämfört med nymalen isolerade celler, såsom en mindre organiserade ultrastruktur, en hög förekomst av utveckla myofibrils11och en hyperpolarisering-aktiverat inåt nuvarande12. Isolering av ventrikulära hjärtmuskelcellerna (VCM) hos råttor och möss från en mängd olika modeller är väl etablerad13,14,15,16,17,18 , 19. i allmänhet exciderad hjärtat är monterad på en av apparatur och retrogradely perfusion med en Ca2 +-gratis buffert som innehåller matsmältningsenzymer, såsom kollagenaser och proteaser. Kalcium är sedan återinförde i en stegvis sätt fysiologiska förhållanden. Men även om protokollen tillägnad isolering av ACMs är tillgängliga20,21, på grund av ökad fibros och tryck-relaterade olikheter, är deras användbarhet i sjukdomsmodeller med förmaksflimmer remodeling begränsad.
I den här artikeln har vi implementerat ett protokoll för isolering av förmaksflimmer encelliga hjärtmuskelcellerna från djur som visar förmaksflimmer remodeling (dvs, i synnerhet för ZFS1 råtta modell för MetS-relaterade HFpEF)22. Befintlig isolering protokoll var optimerad och kompletteras med en enkel, skräddarsydda enhet för att styra och ändra intraluminal trycket av hjärtats hålrum, leder till högre avkastning av morfologiskt och funktionellt intakt hjärtmuskelcellerna. Följande protokoll ger forskaren med stegvisa guide, en detaljerad beskrivning av den skräddarsydda utrustningen, en lista över lösningar, samt en omfattande felsökningsguide.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskrivs vi först ett protokoll för isolering av encelliga ACMs från en råtta modell av MetS-relaterade HFpEF som visar markerade förmaksflimmer remodeling22. Förfarandet är unikt utmanande som överdriven fettvävnad kan göra kirurgisk beredning, liksom kanylering av aorta, allt svårare. Felsökningsguiden anges i tabell 2 adresser de flesta vanliga problem i förfarandet isolering.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av DZHK (tyska centrum för kardiovaskulär forskning, D.B.), EKFS (Else-Kröner-Fresenius Stiftung, F.H.), och av BMBF (tyska ministeriet för utbildning och forskning) samt Bosnien och Hercegovina-Charitéen kliniska forskare program finansieras av Charitéen – Universität Berlin och Berlin Institute of Health (F.H.).
Materials
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
- Alberti, K. G., et al. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity. Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).
- . IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome Available from: https://www.idf.org/e-library/consensus-statements/60-idfconsensus-worldwide-definitionof-the-metabolic-syndrome.html (2006)
- Melenovsky, V., et al. Left atrial remodeling and function in advanced heart failure with preserved or reduced ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 8 (2), 295-303 (2015).
- Goette, A., et al. EHRA/HRS/APHRS/SOLAECE expert consensus on atrial cardiomyopathies: definition, characterization, and clinical implication. EP Europace. 18 (10), 1455-1490 (2016).
- Schotten, U., Verheule, S., Kirchhof, P., Goette, A. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiological Reviews. 91 (1), 265-325 (2011).
- Hohendanner, F., DeSantiago, J., Heinzel, F. R., Blatter, L. A. Dyssynchronous calcium removal in heart failure-induced atrial remodeling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (6), H1352-H1359 (2016).
- Hohendanner, F., et al. Inositol-1,4,5-trisphosphate induced Ca2+ release and excitation-contraction coupling in atrial myocytes from normal and failing hearts. The Journal of Physiology. 593 (6), 1459-1477 (2015).
- Tada, Y., et al. Role of mineralocorticoid receptor on experimental cerebral aneurysms in rats. Hypertension. 54 (3), 552-557 (2009).
- Iwasaki, Y. K., et al. Atrial fibrillation promotion with long-term repetitive obstructive sleep apnea in a rat model. Journal of the American College of Cardiology. 64 (19), 2013-2023 (2014).
- Field, L. J. Atrial natriuretic factor-SV40 T antigen transgenes produce tumors and cardiac arrhythmias in mice. Science. 239 (4843), 1029-1033 (1988).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Sartiani, L., Bochet, P., Cerbai, E., Mugelli, A., Fischmeister, R. Functional expression of the hyperpolarization-activated, non-selective cation current I(f) in immortalized HL-1 cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 545 (Pt 1), 81-92 (2002).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Gunduz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357 (2014).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50289 (2013).
- Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (91), e51109 (2014).
- Thum, T., Borlak, J. Isolation and cultivation of Ca2+ tolerant cardiomyocytes from the adult rat: improvements and applications. Xenobiotica. 30 (11), 1063-1077 (2000).
- Egorova, M. V., Afanas’ev, S. A., Popov, S. V. A simple method for isolation of cardiomyocytes from adult rat heart. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 140 (3), 370-373 (2005).
- Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments. (92), e51823 (2014).
- Hohendanner, F., et al. Cellular mechanisms of metabolic syndrome-related atrial decompensation in a rat model of HFpEF. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 115, 10-19 (2017).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), e2033 (2010).
- Bootman, M. D., Higazi, D. R., Coombes, S., Roderick, H. L. Calcium signalling during excitation-contraction coupling in mammalian atrial myocytes. Journal of Cell Science. 119 (Pt 19), 3915-3925 (2006).
- Smyrnias, I., et al. Comparison of the T-tubule system in adult rat ventricular and atrial myocytes, and its role in excitation-contraction coupling and inotropic stimulation. Cell Calcium. 47 (3), 210-223 (2010).
- Pritchett, A. M., et al. Diastolic dysfunction and left atrial volume: a population-based study. Journal of the American College of Cardiology. 45 (1), 87-92 (2005).
- Linz, D., et al. Cathepsin A mediates susceptibility to atrial tachyarrhythmia and impairment of atrial emptying function in Zucker diabetic fatty rats. Cardiovascular Research. 110 (3), 371-380 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. 생화학. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Deel, E. D., et al. In vitro model to study the effects of matrix stiffening on Ca(2+) handling and myofilament function in isolated adult rat cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 595 (14), 4597-4610 (2017).
- Wuensch, E., Heidrich, H. G. [On the Quantitative Determination of Collagenase]. Hoppe-Seyler’s Zeitschrift für physiologische Chemie. 333, 149-151 (1963).
- Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
- Horgan, S., Watson, C., Glezeva, N., Baugh, J. Murine models of diastolic dysfunction and heart failure with preserved ejection fraction. Journal of Cardiac Failure. 20 (12), 984-995 (2014).
