En temperaturgradient analysen å bestemme termisk preferanser Drosophila larver
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å finne foretrukne miljø temperaturen i Drosophila Larvene bruker kontinuerlig termisk gradering.
Abstract
Mange dyr, inkludert frukt fly, Drosophila melanogaster, er i stand til kresne minutt forskjeller i miljømessige temperatur, slik at de kan oppsøke sine foretrukne termisk landskapet. Definere temperatur preferansene til Larvene over en definert lineær område, utviklet vi en analyse ved hjelp av en temperaturgradient. For å etablere en én-veis gradering, er to aluminium blokker koblet til uavhengige vann bad, hver Kontroller temperaturen på individuelle tekstblokker. De to blokkene satt nedre og øvre grensene for graderingen. Temperaturgradient opprettes ved å plassere en agarose-belagt aluminiumsplate over to vann-kontrollerte blokkene slik at platen spenner over avstanden mellom dem. Endene av aluminiumsplate som er angitt på vann blokkene definerer minimum og maksimum temperaturene, og områdene mellom de to blokkene danner en lineær temperaturgradient. Gradient analysen kan brukes på larver i ulike aldre og kan brukes til å identifisere mutanter som viser fenotyper, som dem med mutasjoner påvirker gener som koder TRP kanaler og opsins, som kreves for temperatur diskriminering.
Introduction
Thermotaxis er ansatt av mobile dyr å velge et miljø med den mest gunstige forhold1,2,3. Hvis klimaet er svært varm eller kald, dette er avgjørende for overlevelse. I tillegg mange dyr er følsomme for svært små forskjeller i temperatur i området behagelig og oppsøke omgivelser med en ideell temperatur. Dette er spesielt viktig for poikilothermic organismer som frukt fluer, som equilibrate kroppstemperaturen med miljøet. Analyser overvåke larver thermotaxis har vært medvirkende i identifisere og klargjøre rollene molekylær sensorer som Drosophila forbigående reseptor potensielle (TRP) kanaler4,5,6, rhodopsins7,8, og ionotropic reseptor reseptorer (IRs)9, som gi gave disse dyrene med temperatur følsomheten over forskjellige temperaturer.
En toveis svaralternativer gir en tilnærming for å studere termisk innstillinger i Larvene6,7. Analysen omfatter å opprette to forskjellige temperatur soner og tillater dyr å velge ene over den andre. Resultatene fra toveis valg tester kan være robust, spesielt hvis mellom de to alternativene er stor. Siden hver analysen omfatter tabulerer bare to grupper, kan i tillegg dataene uttrykkes som en enkel preferanse indeks. Den lette og enkelhet av toveis valg analyser er også mottakelig for genetisk skjermer. En stor begrensning er imidlertid at mange eksperimenter er nødvendig å etablere foretrukne temperaturen av vill-type eller mutant dyr.
En gradient analysen tilbyr muligheten til å opprette foretrukne temperaturen i en singel-analysen8. Videre, i motsetning til toveis valg testen, det tillater evaluering av distribusjon av en gruppe dyr, når konfrontert med et kontinuerlig spekter av temperaturer. En gradient analysen bruker en Petriskål og enkelt dyr og er velegnet for å karakterisere detaljert atferden til enkelte dyr10. Men siden Petri retter er runde, størrelsen på temperatur soner variere og er stadig mindre avhengig av avstanden fra sentrum. Derfor er ikke dette oppsettet ideelt for overvåking temperatur valgene av bestander av dyr.
En kontinuerlig termisk gradient apparater som er tilpasset å vurdere temperatur innstillinger av Larvene har en rektangulær arena, og er beskrevet her. Apparatet er enkelt å konstruere og montere. I tillegg graderingen er lineær, og er fleksible, som det kan brukes til å vurdere thermotaxis over store temperatur varierer fra 10 ° C til 42 ° C. Analysen er rask og enkel å utføre og gir reproduserbar data. I tillegg til rapportering favoriserte temperaturen på larvene, avslører preferansene til befolkningen i dyr over en hel lineær område i et enkelt eksperiment. Fordi disse fordelene er det et utmerket valg for å identifisere gener kreves for thermotaxis.
Protocol
Representative Results
Discussion
For å lykkes med denne protokollen, er det viktig å få tilstrekkelig antall larvae å utføre eksperimenter. Disse inkluderer pre mate flyr i gjær lim inneholder hetteglass for 2-3 d å forbedre egglegging. Ampullene må plasseres på et brett som inneholder vann flasker og vedlagt i en gjennomsiktig plastpose, som gjør at fuktigheten maten og fremmer effektiv fôring larver mens tillater eksponering for vanlig lys-mørk sykluser. Gjær lim bør imidlertid ikke være så myk at fluene bli fanget. Antall kvinner per …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.M. støttes av finansiering fra NEI (EY008117, EY010852) NIDCD (DC007864, DC016278) og NIAID (1DP1AI124453).
Materials
| Gradient assay apparatus | |||
| PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath | Thomas Scientific | 9106 | This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz. |
| Aluminum assay plate (for single directional gradient) | Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized. | ||
| Aluminum plate (for bidirectional gradient) | 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized. | ||
| Aluminum block | Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D. | ||
| Connector for aluminum blocks and tubing | McMaster-Carr | 91355K82 | |
| Tygon Sanitary Silicone Tubing | Tygon | 57296 | 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Items and reagents for assay | |||
| Pestle | USA Scientific | 17361 | Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes |
| Thermometer | Fluke | 51II | |
| Thermocouple | Fluke | K type | |
| Universal microplate lid | Corning | 6980A77 | |
| 35 mm dish | Corning | 9380D40 | |
| Labeling tape (for bidirectional gradient) | Fisher Scientific | 15-951 | Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | Prepare 1% solution |
| Sucrose | Sigma | S0389-5KG | Prepare 18% solution right before starting assay |
| Paint brush | Fisher Scientific | 11860 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Denville | C1062-P | |
| Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| 500 mL round wide-mouth bottle | Pyrex | 1395-500 | |
| Cell strainer (300 mm pore) | PluriSelect | 43-50300 | Optional item for larvae washing |
| Cardboard box (vial tray) | Genesee Scientific | FS32-124 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila food | |||
| Distilled water | 22,400 mL | ||
| Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg | LabScientific Inc. | NC0535320 | 1,609 g |
| Brewers yeast 100 lbs | MP Biomedicals | ICN90331280 | 379 g |
| NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) | Genesee Scientific | 62-115 | 221 g |
| Drosophila Agar, Type II (5 kg) | Genesee Scientific | 66-103 | 190 g |
| Karo light corn syrup | Karo | 1,700 mL | |
| Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) | Sigma Aldrich | H5501-5KG | 72 g/240 mL |
| Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) | Sigma Aldrich | 81910-1 L | 108 mL |
| Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O | Sigma Aldrich | 438081-500 mL | 8.5 mL |
References
- Fowler, M. A., Montell, C. Drosophila TRP channels and animal behavior. Life Sci. 92, 394-403 (2013).
- Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals. Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).
- Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. Peripheral thermosensation in mammals. Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).
- Rosenzweig, M., et al. The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis. Genes Dev. 19, 419-424 (2005).
- Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade. Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).
- Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons. J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).
- Shen, W. L., et al. Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila. Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).
- Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins. Cell Rep. 17, 336-344 (2016).
- Ni, L., et al. The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Luo, L., et al. Navigational decision making in Drosophila thermotaxis. J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: a laboratory handbook. , (2005).
