Un dosage de Gradient de température pour déterminer les préférences thermiques de larves de drosophile
Summary
Nous présentons ici un protocole pour déterminer la température environnementale préférée des larves de drosophile à l’aide d’un gradient thermique continu.
Abstract
Beaucoup d’animaux, y compris la drosophile, Drosophila melanogaster, est capables de discriminant les plus infimes différences dans la température ambiante, ce qui leur permet de tenter de découvrir leur paysage thermique préféré. Pour définir les préférences de température des larves sur une plage linéaire définie, nous avons développé une méthode utilisant un gradient de température. Pour établir un gradient directionnel unique, deux blocs d’aluminium sont connectés à des bains d’eau indépendants, dont chacun contrôle la température des blocs individuels. Les deux blocs défini les limites inférieures et supérieures du dégradé. Le gradient de température est établi en plaçant une plaque en aluminium enduit de gel d’agarose sur les deux blocs d’eau contrôlé afin que la plaque couvre la distance entre eux. Les extrémités de la plaque d’aluminium qui est définie sur le dessus des blocs d’eau définit les températures minimales et maximales, et les régions entre les deux blocs forment un dégradé linéaire de la température. Le test de gradient peut être appliqué à des larves de différents âges et peut être utilisé pour identifier des mutants qui présentent des phénotypes, comme ceux présentant des mutations affectant les gènes codant pour des canaux TRP et opsines, qui sont nécessaires pour la discrimination de température.
Introduction
Thermotactisme est employé par des animaux mobiles pour sélectionner un environnement le plus favorable des conditions1,2,3. Si le climat est trop chaud ou froid, ce comportement est vital pour la survie. En outre, beaucoup d’animaux est sensibles aux très petites différences de température dans la gamme confortable et cherche un cadre avec une température idéale. Ceci est particulièrement important pour les organismes poïkilothermes tels que les mouches des fruits, qui équilibrer la température de leur corps avec l’environnement. Dosages pour surveiller les larve thermotactisme ont contribué à identifier et à clarifier les rôles de capteurs moléculaires comme Drosophila transitoire récepteurs potentiels (TRP) canaux4,5,6, rhodopsines7,8et ionotropiques récepteurs récepteurs (IRs)9, qui empreignent ces animaux avec des sensibilités de température sur différentes plages de températures.
Un test bilatéral choix fournit une approche pour étudier les préférences thermiques en larves6,7. Le test implique l’établissement de deux zones de températures distinctes et permet les animaux sélectionner un côté sur l’autre. Les résultats de tests à choix bidirectionnelle peuvent être robustes, surtout si les différences de température entre les deux options sont grandes. En outre, puisque chaque essai implique tabulating seulement deux groupes, les données peuvent être exprimées comme un indice simple de préférence. La facilité et la simplicité des tests de choix bidirectionnelle se prêtent également aux écrans de génétiques. Toutefois, une limitation majeure est que beaucoup d’expériences est tenus d’établir la température préférée des animaux sauvage ou mutants.
Un test de gradient offre la possibilité d’établir la température préférée en un seul essai8. De plus, contrairement à l’épreuve de choix bidirectionnelle, il permet l’évaluation de la distribution d’un groupe d’animaux, lorsqu’ils sont confrontés avec une gamme continue de températures. Un dosage dégradé utilise une boîte de Pétri et animaux et est bien adapté pour caractériser le comportement détaillé de chaque animal10. Toutefois, étant donné que les boîtes de Pétri sont ronds, les tailles des zones thermiques varient et sont progressivement plus petites selon la distance du centre. Par conséquent, cette configuration n’est pas idéale pour surveiller les sélections de température des populations d’animaux.
Un appareil de gradient thermique continu bien adaptée pour évaluer les préférences de température des groupes de larves emploie une arène rectangulaire et est décrite ici. L’appareil est simple à construire et à assembler. En outre, le gradient est linéaire et est flexible, car il peut être utilisé pour évaluer la thermotactisme plus grande température varie de 10 ° C à 42 ° C. Le test est rapide et simple à réaliser et donne des données reproductibles. En plus de signaler la température favorable des larves, il révèle les préférences de la population d’animaux sur un ensemble linéaire dans une expérience simple. En raison de ces avantages, c’est un excellent choix pour l’identification des gènes nécessaires à thermotactisme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour assurer le succès de ce protocole, il est important de prendre des mesures pour obtenir un nombre suffisant de larves à réaliser les expériences. Il s’agit d’alimentation avant les mouches en flacons pâte contenant de la levure pendant 2-3 jours afin d’améliorer la ponte. Les flacons doivent être placés dans un bac contenant des flacons d’eau et enfermé dans un sac en plastique transparent, qui maintient l’humidité de l’aliment et favorise les efficaces les larves tout en permettant une exposit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.M. est financé par l’IEN (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278) et le NIAID (1DP1AI124453).
Materials
| Gradient assay apparatus | |||
| PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath | Thomas Scientific | 9106 | This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz. |
| Aluminum assay plate (for single directional gradient) | Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized. | ||
| Aluminum plate (for bidirectional gradient) | 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized. | ||
| Aluminum block | Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D. | ||
| Connector for aluminum blocks and tubing | McMaster-Carr | 91355K82 | |
| Tygon Sanitary Silicone Tubing | Tygon | 57296 | 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Items and reagents for assay | |||
| Pestle | USA Scientific | 17361 | Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes |
| Thermometer | Fluke | 51II | |
| Thermocouple | Fluke | K type | |
| Universal microplate lid | Corning | 6980A77 | |
| 35 mm dish | Corning | 9380D40 | |
| Labeling tape (for bidirectional gradient) | Fisher Scientific | 15-951 | Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | Prepare 1% solution |
| Sucrose | Sigma | S0389-5KG | Prepare 18% solution right before starting assay |
| Paint brush | Fisher Scientific | 11860 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Denville | C1062-P | |
| Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| 500 mL round wide-mouth bottle | Pyrex | 1395-500 | |
| Cell strainer (300 mm pore) | PluriSelect | 43-50300 | Optional item for larvae washing |
| Cardboard box (vial tray) | Genesee Scientific | FS32-124 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila food | |||
| Distilled water | 22,400 mL | ||
| Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg | LabScientific Inc. | NC0535320 | 1,609 g |
| Brewers yeast 100 lbs | MP Biomedicals | ICN90331280 | 379 g |
| NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) | Genesee Scientific | 62-115 | 221 g |
| Drosophila Agar, Type II (5 kg) | Genesee Scientific | 66-103 | 190 g |
| Karo light corn syrup | Karo | 1,700 mL | |
| Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) | Sigma Aldrich | H5501-5KG | 72 g/240 mL |
| Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) | Sigma Aldrich | 81910-1 L | 108 mL |
| Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O | Sigma Aldrich | 438081-500 mL | 8.5 mL |
References
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